涎腺腺樣囊性癌中低氧與自噬相關基因的生物信息學研究.pdf

1、生物信息學是一門交叉學科，是結合數(shù)學、計算機科學、統(tǒng)計學、工程學來處理生物學數(shù)據(jù)、研究生物學問題的新興學科，現(xiàn)已在分子生物學的各個領域發(fā)揮著重要作用。生物信息學在醫(yī)學生物學中最廣泛的應用之一，就是在分析基因和蛋白表達、功能注釋以及調控機制的研究中，起到非常積極的作用;在遺傳學及基因組學領域，生物信息學技術可以幫助人們在測序和注釋基因組，以及和基因組相關的可變剪切、突變等方面獲得更多信息;生物信息學圖形技術，例如圖像及信號處理技術，允許科

2、研人員從大量原始數(shù)據(jù)中提取有用的結果;在文本挖掘生物學文獻、生物學數(shù)據(jù)查詢中，生物信息學同樣扮演重要角色。
　　目前生物信息學幾個重要的研究方面，包括表觀遺傳組學、基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等，在腫瘤研究中都有廣泛的應用。其中，代表基因表達數(shù)據(jù)的轉錄組學是應用的最為廣泛的一個方向。包含有數(shù)萬個基因表達情況的的轉錄組數(shù)據(jù)，反映了細胞或組織即刻的生理病理狀態(tài)，同時反映了這一過程中基因的活動信息;通過對比不同條件或不同組織來

3、源的基因表達情況，可以反應內在的基因層面的聯(lián)系，在尋找生物標志物，探究疾病機制機理、評價藥物及其他治療手段效果等方面都有重要作用。目前，基因芯片是生物醫(yī)學研究中最常用的高通量基因檢測的手段之一。
　　基因芯片，是微觀DNA點粘附在固體表面的集合，用芯片同時檢測大量基因表達水平或基因組多個區(qū)域的基因型。由于芯片包含數(shù)以萬計的探針，基因芯片實驗能夠完成許多并行基因測試，在生物醫(yī)學研究中，一方面可以通過運用基因芯片，研究各類疾病發(fā)生發(fā)展

4、的內部機制，建立調控網(wǎng)絡;另一方面也可以應用于尋找疾病的標志物和治療靶點，因此基因芯片技術極大地加速了很多疾病的研究。在現(xiàn)有的腫瘤研究，如肺癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌、肝癌、頭頸鱗癌等各類癌癥的研究中，基因芯片的應用非常廣泛，然而，在涎腺腺樣囊性癌中，基因芯片的應用相對較少。
　　腺樣囊性癌是一種較為少見的惡性腫瘤，可發(fā)生在身體的許多部位，最常發(fā)生在頭頸部，尤其是涎腺，相對于粘液表皮樣癌、多形性腺瘤，腺樣囊性癌是最常見的涎腺惡性腫瘤

5、之一。腺樣囊性癌易復發(fā)，易遠處轉移，同時早期即有侵犯神經(jīng)等較為獨特的生物學行為，目前主要的治療手段是手術聯(lián)合放化療的綜合治療，接受手術的原發(fā)腺樣囊性癌病例的五年、十年、十五年、二十年、二十五年的生存率分別為77.3％，59.6％，44.9％，35.0％，25.5％，總體療效仍然不能令人滿意。近年來，隨著生物醫(yī)學研究的逐步深入，人們對于腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展的研究取得了很大的進展。許多原癌基因、抑癌基因被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，與此

6、同時，也有很多生物學信號通路被發(fā)現(xiàn)在涎腺腺樣囊性癌中過度的活躍或抑制，如mTOR信號通路、NOTCH1信號通路、p53信號通路等等。
　　自噬是在組織微環(huán)境較為惡劣的情況下，細胞內的物質成分通過溶酶體被降解，在自噬溶酶體中，待降解物質在各種酶和蛋白的作用下，分解成氨基酸和核苷酸等，通過三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生可以被重新利用的小分子，是細胞內的一種自我保護機制。在生物進化過程中，自噬這一生物學過程非常保守，廣泛的存在于真核細胞的胚胎發(fā)育、炎

7、癥、氧化應激、低氧、缺血等各種生理或病理過程中。自噬與腫瘤的關系同樣是自噬研究中的一個熱點問題，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，自噬可能參與到了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移等眾多環(huán)節(jié)。而在自噬的啟動方面，低氧是報道最多的環(huán)境因素。
　　低氧作為腫瘤發(fā)展過程中不可避免的微環(huán)境之一，對腫瘤的進展起到了非常重要的作用。在低氧條件下，腫瘤細胞通過改變某些調控因子和蛋白，激活特定的信號通路來調節(jié)腫瘤細胞的生物學活動，這其中就包括自噬。很多學者發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中低

8、氧可以誘導自噬，上調自噬水平，從而促進腫瘤細胞的生存，同時促進腫瘤的生長，在結腸癌、胃癌、前列腺癌中，都有大量關于低氧誘導自噬的相關報道。在這一過程中，低氧誘導因子1α作為細胞應對低氧微環(huán)境的重要轉錄因子，通過對靶基因進行轉錄調控進而調控相應蛋白的表達，在調節(jié)低氧誘導的自噬中起重要作用。因此在低氧誘導自噬這一生物信號通路中，低氧誘導因子1α的表達與自噬基因的關系，很大程度上反應了低氧與自噬的內在聯(lián)系，是研究低氧自噬的關鍵。我們課題組前期

9、實驗中，發(fā)現(xiàn)低氧自噬相關基因在涎腺腺樣囊性癌中表達活躍，與腫瘤的生存及轉移有一定的相關性。然而，涎腺腺樣囊性癌中，用生物信息學技術在基因整體表達水平上對低氧自噬的分析尚未有相關報道。
　　目的:
　　在我們課題組的前期研究中，自噬信號通路與涎腺腺樣囊性癌的預后有顯著的相關性，因此在本研究中，我們在前期實驗的基礎上，利用生物信息學手段，重點研究自噬這一信號通路在涎腺腺樣囊性癌中的表達情況，并分析自噬信號通路在基因水平上的富集情

10、況，探索在涎腺腺樣囊性癌低氧自噬中，低氧誘導因子1α與自噬相關基因的關系，以期對其在涎腺腺樣囊性癌中的作用及調節(jié)機制有更深入的研究。
　　方法:
　　1.從GEO數(shù)據(jù)庫篩選、下載并預處理相關數(shù)據(jù)集，獲得涎腺腺樣囊性癌的基因表達數(shù)據(jù)。
　　2.應用R語言，Wilcoxon秩和檢驗進行差異表達基因分析。
　　3.進行文獻檢索，收集整理自噬相關基因。
　　4.應用超幾何分布檢驗進行自噬通路的富集分析。
　　

11、5.對低氧誘導因子1α基因與自噬基因進行相關分析，并選擇有正相關性的一個自噬基因作為靶基因，作為下一步的研究對象。
　　6.應用免疫組織化學染色法檢驗涎腺腺樣囊性癌組織中低氧誘導因子1α基因與靶基因對應的蛋白表達情況。
　　7.應用二氯化鈷在細胞系ACC-M中構建低氧模型，通過免疫熒光技術，檢測是否有自噬的產(chǎn)生。
　　8.應用二氯化鈷在細胞系ACC-M中構建低氧模型，作用0小時、6小時、12小時、24小時后，應用RT-

12、PCR技術，Western blot技術檢測低氧誘導因子1α基因與靶基因的表達是否具有一致性。
　　結果:
　　1.在數(shù)據(jù)集GSE59701中，共有20201個基因的表達值，以表達值差異超過2倍或者小于0.5倍，P值小于0.05為篩選條件，共篩選出764個上調基因，占總基因數(shù)的3.78％;545個下調基因，占總基因數(shù)的2.70％。
　　2.根據(jù)文獻收集整理出26個自噬相關基因。
　　3.在上調表達基因中，以P值小

13、于0.05為篩選條件，對以上26個自噬相關基因簇進行富集分析，P值等于0.008223，判定該通路上調;在下調表達基因中，對以上26個自噬相關基因簇進行富集分析，P值等于0.446729，無法判定該通路為下調。
　　4.采用了Spearman相關系數(shù)，P值小于0.05為篩選條件，有五個基因ATG3、ATG4A、ATG5、PIK3R4和MAP1LC3B與低氧誘導因子1α基因的表達顯著正相關。
　　5.選擇MAP1LC3B為靶基

14、因。71例涎腺腺樣囊性癌患者的腫瘤組織切片中，進行免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，53例可以觀察到低氧誘導因子1α表達陽性，40例可以觀察到MAP1LC3B對應蛋白表達陽性，25例患者中，低氧誘導因子1α與MAP1LC3B對應蛋白同時表達陽性。
　　6.選取200μ mol/L的二氯化鈷為作用濃度，對ACC-M細胞作用24小時后，通過免疫熒光技術檢測證實，可以誘導ACC-M細胞株中自噬體的產(chǎn)生。
　　7.選取200μ mol/L的二氯化鈷

15、為作用濃度，對ACC-M細胞作用0小時、6小時、12小時、24小時后，通過RT-PCR檢測與Western blot檢測證實，低氧誘導因子1α與基因MAP1LC3B在基因水平和蛋白水平中表達一致性上調。
　　結論:
　　本研究顯示，涎腺腺樣囊性癌中自噬信號通路在基因水平上明顯上調，低氧誘導因子1α基因與ATG3、ATG4A、ATG5、PIK3R4和MAP1LC3B五個基因自噬基因的表達有正相關性，表達趨勢一致。經(jīng)臨床及細胞學