重組人生長(zhǎng)激素干預(yù)GHR不同表達(dá)水平人肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：體外環(huán)境下，觀察重組人生長(zhǎng)激素(recombinant human growth hormone，rhGH)對(duì)生長(zhǎng)激素受體(growth hormone receptor，GHR)不同表達(dá)狀態(tài)的人肝癌細(xì)胞系增殖、凋亡及其胞膜表面GHR密度變化的影響，對(duì)與肝癌細(xì)胞同環(huán)境人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)增殖的影響，并初步探索相關(guān)機(jī)理。
　　 方法：利用體外培養(yǎng)的Bel—7402、HepG2、SMMC7721、QGY—7701、

2、Bel—7405和HCCLM3六種肝癌細(xì)胞，和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)人肝癌細(xì)胞系表面GHR的表達(dá)。然后把各肝癌細(xì)胞系分三組：對(duì)照組、rhGH濃度50ng/ml的rhGH1組和250ng/ml的rhGH2組；通過(guò)ELISA法、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法、流式細(xì)胞術(shù)及熒光染色等手段，觀察rhGH對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、細(xì)胞周期比例、IGF—1分泌等的影響；再設(shè)立ECV304單獨(dú)培養(yǎng)組、SMMC—7721/

3、ECV304共培養(yǎng)組和Bel—7402/ECV304共培養(yǎng)組。用上述干預(yù)方法/和聯(lián)合貝伐單抗干預(yù)，描繪ECV304細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和流式細(xì)胞儀檢測(cè)ECV304周期比例。分別單獨(dú)培養(yǎng)SMMC—7721、Bel—7402，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定肝癌細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)和蛋白分泌情況；最后選取HepG—2、SMMC7721、和QGY—7701，每株細(xì)胞四種處理：未處理組，50ng/mlrh

4、GH干預(yù)組，100ng/mlrhGH干預(yù)組，200ng/mlrhGH干預(yù)組。采用流式、放射性受體分析方法檢測(cè)rhGH處理后細(xì)胞膜表面GHR的表達(dá)情況的變化情況。同時(shí)行四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)熒光染色、ELISA法分析不同濃度rhGH對(duì)人肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、IGF—Ⅰ分泌等的影響。
　　 結(jié)果：Bel—7402、HepG2細(xì)胞過(guò)表達(dá)GHR，與對(duì)照組相比，rhGH體外明顯促其

5、分裂增殖，IGF—1分泌量增加(P<0．05)，且與rhGH濃度無(wú)關(guān)。SMMC7721可疑表達(dá)GHR，QGY—7701、Bel—7405和HCCLM3細(xì)胞均不表達(dá)GHR，rhGH對(duì)其細(xì)胞分裂增殖及IGF—1分泌變化均無(wú)明顯影響(P>0．05)；與Bel—7402、SMMC7721分別共培養(yǎng)ECV304細(xì)胞與單獨(dú)培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞相比，生長(zhǎng)速度加快，倍增時(shí)間縮短，S期升高(P<0．05)。與對(duì)照組比較，rhGH促Bel—7402的VE

6、GF mRNA表達(dá)及蛋白分泌水平均增加，并且與ECV304共培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞S期比例顯著升高，且呈rhGH濃度依賴(P<0．05)，卻未引起細(xì)胞株SMMC—7721發(fā)生相應(yīng)變化(P>0．05)。貝伐單抗封閉VEGF，所有實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)ECV304增殖參數(shù)下調(diào)(P<0．05)，聯(lián)合高濃度rhGH無(wú)法逆轉(zhuǎn)；50、100、200ng/ml rhGH干預(yù)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞胞膜表面GHR密度，熒光強(qiáng)度較未處理組明顯增加(P<0．05)，放射

7、性受體分析法檢測(cè)其胞膜表面GHR位點(diǎn)數(shù)分別為：8．4350±0．2396、9．3957±0．5143、8．3297±0．3133(10^3/cell)，較空白對(duì)照組7．5137±0．5352(10^3/cell)明顯增加(P<0．05)；與未處理組比，rhGH干預(yù)細(xì)胞株SMMC7721及QGY—7701，均未引起胞膜表面GHR密度變化。
　　 結(jié)論：體外環(huán)境下，rhGH可致過(guò)量表達(dá)GHR的人肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)加速、提高其胞膜GHR密