胎盤細胞凋亡在感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運中作用的體外實驗研究.pdf

1、目的:
　　 ①在體外建立共培養(yǎng)模型模擬胎盤屏障的跨細胞轉(zhuǎn)運。②胎盤細胞凋亡在感染HBV的PBMCs轉(zhuǎn)運中作用。
　　 方法:
　　 ①本次實驗采用100μlHBVDNA含量為5x106copies/ml的病人血清感染PBMC，用CCK-8試劑盒檢測不同共培養(yǎng)時間點12h、24h、48h和72h細胞的生長狀況。將共培養(yǎng)的細胞清洗4次，用FQ-PCR法檢測PBMC和洗液中的HBVDNA的含量。
　　 ②在1

2、μm孔徑Transwell小室共培養(yǎng)模型中，用流式細胞技術(shù)(FACS)檢測Transwell小室上室感染HBV的PBMC與BeWo的融合現(xiàn)象。以8μm孔徑Transwell小室共培養(yǎng)模型中，用流式細胞技術(shù)(FACS)檢測下室中是否出現(xiàn)標有綠色熒光的PBMC。
　　 ③本次實驗將共培養(yǎng)模型設(shè)立三個組：正常對照組、HBV與BeWo共培養(yǎng)組、HBV+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組，在共培養(yǎng)0h、12h、24h、48h后分別收集各組細胞通過

3、FACS檢測細胞的凋亡情況。
　　 ④用RT-PCR法檢測HBV+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組不同時間點0h、12h、24h、48h，BeWo細胞的Caspase3mRNA的表達情況。
　　 ⑤用FQ-PCR法檢測HBV+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組下室中的PBMC的HBVDNA和HBVcccDNA含量。
　　 結(jié)果:
　　 ①5×106copies/ml的HBV陽性血清刺激PBMC，共培養(yǎng)12h、24h和4

4、8hPBMC的細胞數(shù)不斷增加，共培養(yǎng)72h左右，細胞數(shù)會減少。與HBV血清共培養(yǎng)48h的PBMC檢測出HBVDNA，提示發(fā)生感染，而清洗細胞的洗液中未檢測出HBVDNA。
　　 ②在1μm孔徑的Transwell小室共培養(yǎng)模型中BeWo細胞被染上了綠色熒光提示HBV+PBMC與BeWo發(fā)生了融合。以8μm孔徑的Transwell小室進行實驗，下室中檢測到標有綠色熒光的PBMC，證明在Transwell小室共培養(yǎng)感染HBV的PBM

5、C與BeWo細胞模擬胎盤屏障的跨細胞轉(zhuǎn)模型構(gòu)建成功。
　　 ③BeWo與HBV血清和HBV+PBMC共培養(yǎng)0h、12h、24h、48h，HBV感染組和HBV+PBMC共培養(yǎng)組的早期凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(F值分別為0.027、1.824、7.186、7.749，P值均大于0.05)。在共培養(yǎng)Oh、12h，HBV感染組和HBV+PBMC共培養(yǎng)組，BeWo總凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（F值分別為2.922、1.3

6、56，P值均大于0.05）；但是共培養(yǎng)24h、48h，HBV感染組總凋亡率與同期的對照組和HBV+PBMC共培養(yǎng)組比較差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為15.678、14.892，P值均小于0.05）。分別對同一組內(nèi)不同時間點的早期凋亡率及總凋亡率進行比較，各組中不同時間點的凋亡率不同，隨著共培養(yǎng)時間的延長，凋亡率呈現(xiàn)增加的趨勢，到48h時HBV感染組總凋亡率為（68.90±0.33）％達到最高。不同時間點早期凋亡率的比較，除了對照組其它各組

7、的差異均有統(tǒng)計學意義(F值分別為3.968、31.648、31.941，對照組P值大于0.05，其他各組P值均小于0.05)，且不同時間點總凋亡率的差異有統(tǒng)計學意義(F值分別為82.827、29.292、63.951，P值均小于0.05)。
　　 ④HBV+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組不同的時間點BeWo細胞Caspase3mRNA的表達量相比較差別有統(tǒng)計學意義(F=38.114，P=0.002)，且各組間兩兩比較后，除12h與O

8、h外，Caspase3mRNA的相對表達量相比無差異外，其他各組間差異均有統(tǒng)計學意義。在24h和48h組中，隨著時間的延長Caspase3mRNA的相對表達量有升高的趨勢。
　　 ⑤在BeWo細胞和HBV+PBMC共培養(yǎng)組中，BeWo細胞早期凋亡率與PBMC遷移率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.908，p=0.002)，BeWo細胞總凋亡率與PBMC遷移率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.969，p=0.001)。BeWo細胞Caspase3mRNA

9、相對表達量和PBMC遷移率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.950，p=0.00l)。
　　 ⑥HBV+PBMC與BeWo細胞共培養(yǎng)24h和48h時，下室的PBMCHBVDNA拷貝數(shù)分別為(1.925±0.43l)x103copies/ml、(2.565±0.36l)x103copies/ml，同時，在此時間點HBVcccDNA的拷貝數(shù)分別為(7.560±1.513)x102copies/ml、(1.3550±2.473)x103copie

10、s/ml，按判斷標準HBVDNA拷貝數(shù)≥103copies/ml為陽性，提示此時間點下室中的PBMC發(fā)生感染，且按判斷標準HBVcccDNA拷貝數(shù)≥5X102copies/ml為陽性，提示HBV發(fā)生復(fù)制。
　　 結(jié)論:
　　 ①乙型肝炎病毒能夠在PBMC中復(fù)制，并在體外成功構(gòu)建BeWo細胞與感染HBV的PBMC共培養(yǎng)模型模擬胎盤屏障的跨細胞轉(zhuǎn)運。
　　 ②胎盤細胞凋亡率與PBMC的遷移率的正相關(guān)關(guān)系，提示凋亡可能