Orai1在PC12細(xì)胞和大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分化過程中作用機(jī)制的研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫排空引起的通過鈣庫操控性鈣通道的鈣離子內(nèi)流在大多數(shù)興奮性細(xì)胞中也被證實(shí)為重要的鈣離子內(nèi)流途徑。而Orai1蛋白作為鈣釋放激活性鈣通道的組成亞基,廣泛表達(dá)在哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)中。Orai1蛋白具有多種生理功能,例如:鈣庫操控性鈣通道的組成部分、接受外來刺激的受體或蛋白相互作用的支架等。已有研究證實(shí)由鈣庫操控性鈣通道介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高會誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的分化,但是其相關(guān)機(jī)制少有研究。在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)用慢病毒敲除Orai1

2、蛋白能夠抑制PC12細(xì)胞突起形成,而且在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中,神經(jīng)元的樹突棘出現(xiàn)缺失,生長錐對神經(jīng)營養(yǎng)因子的反應(yīng)消失。有趣的是,當(dāng)我們用PKC的抑制劑GF109203x預(yù)處理細(xì)胞時,敲除Orai1蛋白對神經(jīng)細(xì)胞分化的抑制作用會進(jìn)一步增強(qiáng);鈣影像結(jié)果顯示:GF109203x能夠抑制Tg誘導(dǎo)的細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流;Western結(jié)果顯示,:GF109203x能夠抑制PC12細(xì)胞的MAPK磷酸化;生長錐反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示:GF109203x能使生長錐對神經(jīng)

3、營養(yǎng)因子的反應(yīng)消失。因此,根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測Orai1蛋白對神經(jīng)細(xì)胞的分化作用的影響與Rap1-MAPK和PKC信號途徑相關(guān),并且是保持神經(jīng)細(xì)胞完整性和興奮性的必要調(diào)節(jié)因子。
　　因此,我們的研究中首次報道沉默Orai1對興奮性細(xì)胞PC12細(xì)胞的分化、對原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元樹突棘的形成、生長錐分化均有抑制作用。Orai1蛋白功能機(jī)制的探究很有可能成為神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病研究的新靶點(diǎn)。論文共包括三部分,其主要內(nèi)容與結(jié)果如下:

4、r>　　一.鈣影像結(jié)果顯示沉默Orai1的效果在PC12細(xì)胞被NGF誘導(dǎo)后更明顯,而且PKC抑制劑GF109203X增強(qiáng)Orai1沉默效果
　　利用沉默Orai1蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系,實(shí)驗(yàn)在兩種條件下進(jìn)行,通過鈣影像分析在Tg誘導(dǎo)下,SOCE的變化情況。首先,在未分化條件下,用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對照組(shconGFx)與正常對照組(shcon)相比,Δ340/380減少了48％(p<0.05);用PKC抑

5、制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組(shOGFx)與未處理沉默Orai1蛋白組(shO)相比,Δ340/380變化幅度沒有統(tǒng)計學(xué)意義;未處理沉默Orai1蛋白組(shO)與正常對照組(shcon)相比,Δ340/380減少了75%(p<0.001);用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組(shOGFx)與用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對照組(shconGFx)相比,

6、Δ340/380減少了50%(p<0.001)。接著,在100ng/mlNGF刺激下,用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對照組(shconGFx)與正常對照組(shcon)相比,Δ340/380減少了25%(p<0.05);用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組(shOGFx)與未處理沉默Orai1蛋白組(shO)相比,Δ340/380減少了83%(p<0.05);未處理沉默Orai1蛋白組(

7、shO)與正常對照組(shcon)相比,Δ340/380減少了70%(p<0.001);用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組(shOGFx)與用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對照組(shconGFx)相比,Δ340/380減少了80%(p<0.001)。
　　二.沉默Orai1抑制NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞neuriteoutgrowth生長,降低MAPK的磷酸化和Rap-GTP活化水

8、平;PKC抑制劑GF109203x能夠增強(qiáng)Orai1沉默的抑制功能
　　利用沉默Orai1蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系,同樣在不同的兩種條件下觀察細(xì)胞形態(tài)。如圖所示,在未分化條件下,shcon組細(xì)胞僅看到少量短突起,視為未分化。在100ng/mlNGF刺激下,根據(jù)分化陽性細(xì)胞選取原則:neuriteoutgrowth突起長度大于或等于胞體直徑則視為分化陽性細(xì)胞。用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對照組(shconGFx)與正常對

9、照組(shcon)相比,細(xì)胞分化程度降低45%;用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組(shOGFx)與未處理沉默Orai1蛋白組(shO)相比,細(xì)胞分化程度降低50%。未處理沉默Orai1蛋白組(shO)與正常對照組(shcon)相比,細(xì)胞分化程度降低80%;用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組(shOGFx)與用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對照組(shc

10、onGFx)相比,細(xì)胞分化程度降低80%。
　　通過蛋白質(zhì)免疫印跡法分析沉默Orai1蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系中MAPK磷酸化水平和Rap1-GTP活化水平,用Tg預(yù)處理的細(xì)胞比未處理的細(xì)胞MAPK磷酸化程度增強(qiáng),但是當(dāng)沉默細(xì)胞內(nèi)Orai1蛋白后,MAPK磷酸化程度減弱;當(dāng)所有組別細(xì)胞均用GFx預(yù)處理后,用Tg預(yù)處理的細(xì)胞比未處理的細(xì)胞MAPK磷酸化程度明顯增強(qiáng),但是當(dāng)沉默細(xì)胞內(nèi)Orai1蛋白后,MAPK磷酸化程度明顯減弱。用Tg預(yù)處理的

11、細(xì)胞比未處理的細(xì)胞內(nèi)Rap1-GTP水平升高,但是當(dāng)沉默細(xì)胞內(nèi)Orai1蛋白后,細(xì)胞內(nèi)Rap1-GTP水平降低;當(dāng)所有組別細(xì)胞均用GFx預(yù)處理后,用Tg預(yù)處理的細(xì)胞比未處理的細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Rap1-GTP水平升高,但是當(dāng)沉默細(xì)胞內(nèi)Orai1蛋白后,細(xì)胞內(nèi)Rap1-GTP的水平降低。
　　三.大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)中光鏡觀察到沉默Orai1神經(jīng)元的軸突對NGF吸引反應(yīng)消失,通過電鏡觀察沉默Orai1神經(jīng)元的樹突棘出現(xiàn)缺失
　　一方

12、面,NGF對沉默Orai1神經(jīng)元生長錐的吸引反應(yīng)消失。當(dāng)用NGF刺激神經(jīng)元30分鐘后,對照組細(xì)胞生長錐有明顯的轉(zhuǎn)向反應(yīng)。在沉默Orai1神經(jīng)元組中我們并沒有觀察到生長錐的轉(zhuǎn)向反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中生長錐只有長到一定長度后才能觀察到明顯的轉(zhuǎn)向反應(yīng),因而我們在實(shí)驗(yàn)中只收集生長長度大于10μm的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　另一方面,利用包裝好的慢病毒shconRNA,shOrai1RNA感染原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元,培養(yǎng)21天后觀察樹突棘密度;對照組神經(jīng)元樹突上