SOCS-3在慢性肝損傷中的表達(dá)研究及大鼠SOCS-3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、目的:探索細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-3(Suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3)在慢性肝損傷肝組織中的表達(dá),闡明其在慢性肝損傷中的作用。通過構(gòu)建大鼠細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-3(SOCS-3)基因的重組pcDNA3.1質(zhì)粒,為進(jìn)一步研究該基因在慢性肝損傷的作用提供技術(shù)平臺(tái)。
　　 方法:1.清潔級(jí)雄性健康Wistar大鼠48只,設(shè)置模型組(36只)和對(duì)照組(12只)。模型組40％四氯化

2、碳(Carbon tetrachloride,CCL4)花生油溶液皮下注射建立慢性肝損傷模型,對(duì)照組以同等條件注射花生油,于第4、6、8、10周收集血液和肝臟組織。2.肝臟組織SOCS-3 mRNA采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。3.肝臟組織SOCS-3蛋白采用免疫組化SP法檢測(cè)。4.肝功能ALT、AST檢測(cè),由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助完成。5.血清腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)采用放射

3、免疫法檢測(cè),由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科協(xié)助完成。6.肝臟病理檢查:HE染色,顯微鏡下按Knodell HAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肝臟炎癥、肝纖維化進(jìn)行評(píng)分。7.設(shè)計(jì)特異性引物,利用大鼠肝臟組織中提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增出目的片段,采用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和Bam HⅠ雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1,得到的SOCS-3基因片段與已切的載體pcDNA3.1,根據(jù)摩爾比3:1連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5-α,后長(zhǎng)出的克隆仍采取雙酶

4、切鑒定,陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),模型組和對(duì)照組采用獨(dú)立樣本t(Independent-Samples T Test)檢驗(yàn),模型組與組之間采用單因素方差分析(One way ANOVA)。
　　 結(jié)果:1.模型組4周時(shí)肝功能無(wú)明顯異常,肝組織有輕微炎癥表現(xiàn),但很少有肝纖維化出現(xiàn),6、8、10周時(shí)肝功能明顯異常,肝臟

5、炎癥較前明顯加重,肝纖維化程度加重,至10周時(shí)均有肝硬化表現(xiàn),而對(duì)照組肝臟組織無(wú)明顯炎癥表現(xiàn),也無(wú)纖維化表現(xiàn)。2.慢性肝損傷模型組SOCS-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨肝損傷程度加重而逐漸增加,模型組4周時(shí)為2.13±0.79,6周時(shí)為3.42±0.49,8周時(shí)為4.24±0.48,10周時(shí)為6.09±1.08,而對(duì)照組4周時(shí)為0.62±0.34,6周時(shí)為0.71±0.30,8周時(shí)為0.71±0.31,10周時(shí)為0.83±0.24,模型組S

6、OCS-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組第4、6、8、10周與周間比較,SOCS-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3.免疫組化檢測(cè)肝臟組織SOCS-3蛋白表達(dá),顯示陽(yáng)性染色呈棕黃色,表達(dá)主要集中在細(xì)胞漿。對(duì)照組SOCS-3蛋白表達(dá)很少,與對(duì)照組比較,模型組SOCS-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。通過對(duì)各組SOCS-3蛋白平均光密度值分析,顯示對(duì)照組和模型組在4、6、8、10周組間

7、兩兩比較,SOCS-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),對(duì)照組明顯低于模型組；模型組在4、6、8、10周與周間比較,SOCS-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.SOCS-3 mRNA和SOCS-3蛋白與ALT、AST、TNF-α、肝組織炎癥及纖維化Knodell HAI評(píng)分相關(guān)性分析:在慢性肝損傷時(shí),SOCS-3 mRNA和SOCS-3蛋白與ALT、AST、TNF-α、肝組織炎癥及纖維化Knodel

8、l HAI評(píng)分呈正相關(guān)。5.構(gòu)建大鼠細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-3(SOCS-3)基因的重組pcDNA3.1質(zhì)粒通過酶切證實(shí)大鼠SOCS-3基因被成功的克隆到質(zhì)粒pcDNA3.1載體中,測(cè)序結(jié)果證明重組質(zhì)粒載體的插入序列與設(shè)計(jì)的靶基因序列一致。
　　 結(jié)論:1.在慢性肝損傷中,隨著肝臟損傷加重,受到炎癥因子持續(xù)刺激,SOCS-3 mRNA及其蛋白表達(dá)逐漸增加,其表達(dá)與炎癥和纖維化程度有關(guān)。2.成功構(gòu)建大鼠SOCS-3基因的真核表達(dá)