DNA剪切修復對MPTP-MPP+致帕金森病模型DNA氧化損傷的作用研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是僅次于是阿爾茨海默病的第二大神經退行性疾病，其主要病理特征為黑質致密部大量多巴胺能神經元變性或丟失。研究顯示，PD病人黑質多巴胺能神經元內DNA氧化損傷嚴重，若不被及時有效的修復，則可能導致神經元死亡。在多種DNA修復機制中，最主要和最重要的是DNA剪切修復，它可以分為堿基切除修復(base excision repair，BER)和核苷酸切除修復(nucleotide exci

2、sion repair，NER)。BER和NER分別依賴于多種蛋白的相互作用，其中，8-氧基-鳥嘌玲DNA糖苷酶(8-oxoguanosine DNA glycosylase，OGG1)是BER的限速因子；而著色性干皮病蛋白A、B、F、G(xeroderma pigmentosumfactor A，B，F(xiàn)，G，XPA，XPB，XPF，XPG)是NER不可或缺的蛋白因子；細胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear

3、 antigen，PCNA)是BER和NER共同需要的蛋白因子；以上蛋白的表達變化分別反映了細胞內BER和NER的修復活性變化。
　　然而，在PD等神經退行性疾病病理情況下，DNA氧化損傷與DNA剪切修復的關系及其相關蛋白表達變化卻仍未知。為探討DNA氧化損傷與DNA剪切修復在PD病理機制中的作用，本論文在Mpp+(1-methyl-4-phenyl-pyridinium)致PC12細胞的PD細胞模型上采用相差顯微技術和MTT實驗

4、觀察了細胞的形態(tài)和活力變化，并采用Hochest染色觀察細胞的凋亡情況，隨后采用Western-blot技術檢測了BER相關蛋白OGG1和NER相關蛋白XRA、XPB、XPF、XPG以及BER和NER共同的蛋白因子PCNA的表達變化，最后用8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine(8-oxodG)免疫細胞化學染色技術研究了DNA氧化損傷情況；在MPTP(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-t

5、etrahydropyridine)致C57BL/6小鼠的PD動物模型上研究了黑質內BER和NER相關蛋白的表達變化情況，現(xiàn)將實驗結果概述如下：
　　1.PC12細胞的形態(tài)和活力變化
　　相差顯微技術的結果顯示，MPP+處理不同時間對PC12細胞的形態(tài)影響不大，但是處理24h后，細胞貼壁能力降低；而MTT實驗結果顯示，MPP+處理PC12細胞18h和24h后，細胞活力顯著下降，分別降至78.6％和70.8％。
　　2.

6、PC12細胞的凋亡情況研究
　　我們進一步用Hochest染色來觀察細胞的凋亡情況，結果顯示，MPP+處理PC12細胞18h后，有凋亡細胞出現(xiàn)，24h后凋亡現(xiàn)象進一步發(fā)展，但是凋亡細胞增加并不顯著，提示MPP+氧化損傷并不顯著增加凋亡細胞的數目。
　　3.PC12細胞的BER和NER相關蛋白的表達變化
　　以上結果提示，Mpp+氧化損傷對細胞形態(tài)和細胞的凋亡影響不大，但卻時程依賴性地使細胞活力顯著降低，這可能與細胞內應

7、對損傷的DNA修復能力降低相關；已知MPP+是特異地介導細胞DNA氧化損傷的物質，而細胞應對DNA氧化損傷的修復機制主要是DNA剪切修復，因此，我們采用Western-blot技術結合光密度分析的方法檢測了MPP+處理不同時間后，PC12細胞內BER和NER相關蛋白的表達變化。光密度分析及統(tǒng)計結果顯示，BER限速因子OGG1的表達水平在處理1h后即顯著升高，比對照升高5.0倍；3h后達到高峰，升高6.4倍；之后依次下降，24h低于對照。

8、與之對應的是，NER的各相關蛋白表達水平變化顯著，XPA、XPB、XPF、XPG和PCNA在MPP+處理1h后即顯著上調，分別增加4.2倍、2.0倍、2.0倍、2.7倍和1.9倍；隨著MPP+處理時間的延長，各因子的表達量繼續(xù)上調，其中XPA和PCNA分別在12h和3h達到高峰，分別增加3.4倍和2.5倍，而XPB、XPF和XPG均在18h到達高峰，分別增加3.4倍、3.9倍和3.9倍；24h后，各蛋白表達水平均下降，其中PCNA顯著低

9、于對照。
　　4.PC12細胞的DNA氧化損傷情況研究
　　以上結果提示，MPP+氧化損傷能上調BER和NER相關蛋白的表達水平，提示細胞內DNA剪切修復能應對DNA氧化損傷，但隨著MPP+處理時間的延長，BER和NER的修復能力均下降，且細胞活力下降顯著，這可能與DNA氧化損傷嚴重有關，因此我們進一步用8-oxodG免疫細胞化學染色來觀察細胞的DNA氧化損傷。結果顯示，對照細胞的8-oxodG免疫陽性細胞主要分布于線粒體，

10、含量低；18h后，同時分布于線粒體和核，含量增多；24h后，主要集中在細胞核，含量最多，損傷最嚴重。結果提示，MPP+氧化損傷引起PC12細胞的DNA氧化損傷程度加劇，隨著處理時間的延長，氧化損傷的標志性產物8-oxodG的分布，從線粒體逐步過渡到細胞核。推測細胞內BER和NER蛋白表達水平下降進而導致DNA剪切修復能力降低的原因是DNA氧化損傷加劇。
　　5.C57BL/6小鼠黑質內BER和NER相關蛋白的表達變化以上結果提示，

11、在PD細胞模型上，隨著DNA氧化損傷程度的改變，細胞內DNA剪切修復(BER和NER)相關蛋白表達變化顯著，DNA氧化損傷加劇導致細胞BER和NER相關蛋白表達下降，DNA剪切修復能力降低。為了進一步探討DNA氧化損傷加劇與DNA剪切修復相關蛋白的表達變化之間的關系，我們首先采用Western-blot結合光密度分析的方法檢測了MPTP腹腔注射C57BL/6小鼠3d后黑質多巴胺能神經元的標志酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxy

12、lase，TH)的表達，結果顯示TH表達顯著下降，與對照相比降低63％。隨后檢測了BER和NER相關蛋白的表達變化。光密度分析及統(tǒng)計結果顯示，OGG1和PCNA表達水平降低不明顯，但XPA、XPB和XPG均顯著下降，與對照相比，分別降低47％、58％和68％：此外，正常情況下黑質內(SN)的BER和NER相關蛋白表達的基線水平也差異顯著，OGG1比對照(中腦除黑質以外的其他部位，SN-)低16倍，而XPA、XPB和XPG比SN-高1倍。

13、以上結果提示，正常情況下黑質內BER功能低下而NER相對要高；當DNA氧化損傷加劇導致NER能力降低，可能是PD發(fā)病的原因之一。
　　小結：
　　1)在PD的細胞模型上，MPP+氧化損傷對PC12細胞的形態(tài)和凋亡情況影響不大，但顯著降低細胞活力。隨著MPP+處理時間延長，細胞DNA氧化損傷加劇。
　　2)在PD的細胞模型上，隨DNA氧化損傷程度的增加，PC12細胞BER和NER相關蛋白的蛋白表達水平變化顯著；DNA氧化

14、損傷加劇導致BER和NER相關蛋白表達水平下降。
　　3)在PD的動物模型上，MPTP氧化損傷導致C57BL/6小鼠黑質的NER相關蛋白表達水平顯著下降。
　　結論及意義：
　　在PD的細胞和動物模型上，NER相關蛋白表達水平隨DNA氧化損傷程度的加劇而顯著下降。結果提示，DNA氧化損傷加劇引起DNA剪切修復能力尤其是NER修復能力下降，加重了神經元的損傷并導致其死亡，這可能是PD發(fā)病機制之一。該研究可能為闡明PD病理