大鼠胰腺發(fā)育過程中胰島素釋放功能完善及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究大鼠胰腺發(fā)育不同階段基因表達(dá)譜，分析胰島素合成和釋放過程中的關(guān)鍵基因表達(dá)特點(diǎn)，并明確胚胎發(fā)育正常及異常大鼠胰島素釋放功能的完善過程及其胰島功能異常的機(jī)制。 方法：1、應(yīng)用顯微分離及提取技術(shù)獲得胚胎發(fā)育12.5天(E12.5)、15.5天(E15.5)、18.5天(E18.5)、新生大鼠(N)、出生后21天(P21)及成年(A)SD大鼠的胰腺組織。 2、利用Affymetrix公司生產(chǎn)的高密度寡核苷酸芯片檢測(cè)大鼠

2、發(fā)育各階段胰腺內(nèi)外分泌基因表達(dá)譜；用生物信息學(xué)技術(shù)，結(jié)合UCSC、TRANSFAC、NCBI等公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，對(duì)各時(shí)期芯片結(jié)果尤其是胰島素合成及釋放相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析；并用RT-PCR及realtimePCR對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 3、運(yùn)用RT-PCR、Westernblot、免疫組化、免疫熒光等技術(shù)確定胰島素釋放關(guān)鍵基因的定位及其基因、蛋白表達(dá)情況。 4、腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)檢測(cè)大鼠胰島功能，ELIS

3、A法測(cè)定血中胰島素濃度。 5、從大鼠胚胎發(fā)育14天開始給予孕鼠半量飲食直至新生鼠出生，造成宮內(nèi)發(fā)育遲緩動(dòng)物模型，宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠出生后，部分給予正常哺乳，部分繼續(xù)給與半量飲食，觀察其體重和胰腺重量的變化，提取宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠胰腺組織，檢測(cè)胰島素合成釋放相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)；經(jīng)鼻尖采血收集新生后不同天數(shù)的鼠血，腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)觀察其胰島功能并測(cè)定血胰島素水平的變化。 結(jié)果：1、RAE230A芯片共包含15851個(gè)

4、基因，E12.5、E15.5、E18.5、N、A等時(shí)期大鼠基因的檢出率分別為60.3﹪、66.5﹪、64.4﹪、63.4﹪、40.3﹪。將所有基因歸納為以下8類：(1)轉(zhuǎn)錄因子類；(2)酶類；(3)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類；(4)激素、受體、生長(zhǎng)因子類；(5)原癌基因類；(6)細(xì)胞骨架類；(7)凝血、免疫和其它類；(8)表達(dá)序列標(biāo)識(shí)(est)。 2、大鼠胚胎胰腺發(fā)育至E12.5時(shí)，細(xì)胞分化相關(guān)基因高度表達(dá)；E18.5時(shí)，內(nèi)分泌典型胰島結(jié)構(gòu)及外

5、分泌腺泡、導(dǎo)管結(jié)構(gòu)已基本形成；E18.5與E15.5相比較，E18.5時(shí)功能細(xì)胞分化相關(guān)基因如hnf6、ISL1、Pdx-1表達(dá)明顯下降，而細(xì)胞代謝功能調(diào)節(jié)基因如hnf1a、hnf4a表達(dá)明顯上調(diào)，胰島素基因、胰淀粉酶基因的表達(dá)分別上調(diào)16倍、2倍以上；此后，主要是內(nèi)外分泌胰腺功能完善相關(guān)基因高表達(dá)。 3、在胰島素合成及釋放相關(guān)基因中，胰島素基因及其特異性轉(zhuǎn)錄因子在大鼠E12.5-E15.5天時(shí)即開始有表達(dá)，以后胰島素基因持續(xù)存

6、在且表達(dá)增多；作為胞吐分子構(gòu)件及調(diào)節(jié)的相關(guān)基因syntaxin-1a、vamp-2、Rab3a、munc13-1等從E15.5天左右開始出現(xiàn)，以后表達(dá)量亦增多；而葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)相關(guān)的基因中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Glut2)在胚胎早期開始表達(dá)，而葡萄糖激酶(GCK)則出現(xiàn)于胚胎中晚期。 4、自E18.5即檢測(cè)到血中胰島素的存在，隨著胚胎的發(fā)育，血胰島素濃度逐漸升高。正常新生大鼠空腹血糖正常，但出生一周以前的大鼠對(duì)葡萄

7、糖負(fù)荷不能耐受，餐后血糖高，出生一周以后腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)才逐漸趨于正常。 5、宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠體重及胰腺重量明顯下降，血糖水平高、血胰島素水平降低，同時(shí)胰島素釋放相關(guān)基因munc13-1，syntaxin1a等的表達(dá)減少，葡萄糖耐量異常。給予正常飲食后，胰島功能能逐漸恢復(fù)，但I(xiàn)PGTT不是在出生后一周，而是需更多時(shí)日才逐漸趨于正常。 6、Munc13-1表達(dá)于胰島β細(xì)胞，隨著胚胎發(fā)育期胰島素分泌的增多

8、表達(dá)也增加；宮內(nèi)發(fā)育遲緩時(shí)，胰島素分泌減少，munc13-1的基因及蛋白表達(dá)量亦比正常對(duì)照組明顯減少。 結(jié)論：1、E12.5～E15.5時(shí)，胰腺內(nèi)外分泌部分分化旺盛，E15.5～E18.5時(shí)，胰腺內(nèi)外分泌部分化已基本完成，功能細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)功能開始完善，此后，以功能完善為主。 2、大鼠胚胎胰腺發(fā)育早中期開始即已具備胰島素的合成及分泌能力，而葡萄糖刺激的胰島素分泌能力在胚胎中晚期才出現(xiàn)。 3、雖然大鼠胚胎發(fā)育中晚期