重組人骨形成蛋白2促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞分化的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma GB)是大腦最好發(fā)的,惡性程度最高的星形細(xì)胞腫瘤,大約占顱內(nèi)腫瘤的12~15％。臨床上患者以腫瘤反復(fù)復(fù)發(fā)和快速死亡為特征,單次手術(shù)切除后患者中位生存期僅為17周;手術(shù)聯(lián)合放化療治療,也不能使GB患者的中位生存期達(dá)到1年,多數(shù)患者仍然死于GB的復(fù)發(fā),因此迫切需要尋找新的治療方法。
　　腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells CSCs)是惡性腫瘤內(nèi)極少量的種子細(xì)胞,

2、也是導(dǎo)致腫瘤耐藥、高致死率和高復(fù)發(fā)率的關(guān)鍵因素。CSCs具有無限自我更新、無限增殖、多向分化的潛能。誘導(dǎo)分化治療正是利用CSCs具有多向分化的特點,應(yīng)用安全無毒的藥物誘導(dǎo)CSCs向正常組織細(xì)胞分化,降低其致瘤性;促進(jìn)CSCs從靜止?fàn)顟B(tài)分化進(jìn)入分裂期,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化學(xué)藥物的敏感性,消除其耐藥性,并不損傷周圍正常組織。這是近20年來腫瘤治療的重大突破,已應(yīng)用于血液腫瘤的臨床治療。但在GB等實體腫瘤的治療領(lǐng)域始終沒有突破性進(jìn)展,其主要原因是

3、尚沒有長效而無毒的藥品可以應(yīng)用。
　　骨形成蛋白(bone morphogenetic protein BMP)屬于TGF-β家族,是結(jié)構(gòu)類似的高度保守的功能蛋白質(zhì)族,已發(fā)現(xiàn)有40多個成員,相對分子量在28-30kDa,廣泛分布于人體多種組織和細(xì)胞,具有多重功能。其重要成員BMP2是使神經(jīng)祖細(xì)胞從神經(jīng)發(fā)生向膠質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化的重要開關(guān)。體外實驗證實,BMP2能改變神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells NSCs)的分化方向,誘導(dǎo)

4、端腦的NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。近年來,BMP2介導(dǎo)的生長調(diào)節(jié)作用被廣泛研究于腫瘤中,這些功能多種多樣。但BMP2是否能夠促進(jìn)GB干細(xì)胞(glioblastoma stem cells GSCs)的分化,影響GB的惡性生物學(xué)特征及其分子機(jī)制還不清楚;另外需要深入研究BMP2是否有望應(yīng)用于臨床GB的綜合治療中,這些研究可能會為GB的治療帶來新的希望。
　　研究目的:
　　本研究旨在應(yīng)用rhBMP2蛋白誘導(dǎo)GSCs分化為成熟的

5、膠質(zhì)細(xì)胞;通過誘導(dǎo)分化的方法,以期改良其惡性生物學(xué)行為;進(jìn)行60Co-γ射線輻照聯(lián)合rhBMP2,模擬放療聯(lián)合誘導(dǎo)分化的臨床綜合治療的體外環(huán)境,觀察rhBMP2對腫瘤細(xì)胞的放療敏感性的影響;初步研究rhBMP2發(fā)揮作用的分子機(jī)制,為GB的分化治療提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1、GB組織的原代培養(yǎng)和膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系篩選,獲得GSCs,進(jìn)行GSCs克隆球的培養(yǎng)和鑒定。
　　2、用rhBMP2蛋白干預(yù)GSCs,觀

6、察分化后的細(xì)胞中,膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP的表達(dá)狀況;觀察rhBMP2促進(jìn)GSCs分化后,細(xì)胞的增殖和自我更新能力的變化;分析rhBMP2發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　3、用不同劑量60Co-γ射線輻照聯(lián)合rhBMP2干預(yù),模擬臨床綜合治療的體外環(huán)境,觀察聯(lián)合處理對GSCs分化的影響;通過細(xì)胞周期和克隆形成能力的檢測,分析rhBMP2促進(jìn)GSCs分化對60Co-γ射線刺激敏感性的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1、成功篩選并培

7、養(yǎng)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系的干細(xì)胞克隆球,建立了膠質(zhì)瘤細(xì)胞系干細(xì)胞培養(yǎng)簡單易行的新方法。
　　與傳統(tǒng)方法不用,我們應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),根據(jù)細(xì)胞的不同生長狀態(tài),將懸浮細(xì)胞收集起來,培養(yǎng)于添加了生長因子的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),進(jìn)行條件性培養(yǎng),最終形成GSC克隆球。我們通過增殖實驗、自我更新實驗、細(xì)胞周期測定和干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白及相關(guān)基因的檢測,證實了GSC克隆球的干細(xì)胞身份。
　　2、rhBMP2蛋白可能通過抑制EZH2的活性促進(jìn)GS

8、Cs分化,降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力和自我更新能力。
　　我們用rhBMP2蛋白干預(yù)GSCs,通過免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn),rhBMP2干預(yù)能夠促進(jìn)分化細(xì)胞內(nèi)GFAP蛋白的表達(dá)水平升高;通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),rhBMP2干預(yù)后,細(xì)胞漿內(nèi)GFAP蛋白表達(dá)量增多,且呈細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)分布;克隆球更容易貼壁分化。同時干細(xì)胞相關(guān)基因Sox-2mRNA水平降低,這些結(jié)果說明rhBMP2能促進(jìn)GSCs分化;通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,證實rhBMP2不影響細(xì)

9、胞的凋亡,因此認(rèn)為rhBMP2無毒性作用。我們通過對分化細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力檢測,明確了rhBMP2通過促進(jìn)GSCs分化,降低腫瘤細(xì)胞增殖和自我更新能力。通過檢測與干細(xì)胞分化相關(guān)的信號通路中部分關(guān)鍵蛋白(EZH2、Smad4、Wnt5a、β-catenin)的表達(dá)水平,提示rhBMP2可能通過抑制EZH2的活性發(fā)揮促進(jìn)GSCs分化的作用。
　　3、60Co-γ射線輻照聯(lián)合rhBMP2干預(yù),能夠高效的促進(jìn)GSCs細(xì)胞向成熟膠

10、質(zhì)細(xì)胞分化,從而增強(qiáng)GSCs對60Co-γ射線輻照的敏感性,降低輻照后腫瘤細(xì)胞的自我更新能力。
　　高劑量(20gy)或低劑量(0.25gy)60Co-γ射線輻照聯(lián)合rhBMP2干預(yù),細(xì)胞內(nèi)GFAP蛋白表達(dá)量均明顯升高,而且在細(xì)胞漿呈細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)分布。我們進(jìn)行細(xì)胞周期測定發(fā)現(xiàn),rhBMP能夠促進(jìn)60Co-γ射線輻照后,細(xì)胞由G0/G1期向S期進(jìn)展,說明,60Co-γ射線輻照聯(lián)合rhBMP2,能夠促進(jìn)GSCs由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)向增殖狀態(tài)。提

11、示,rhBMP2能夠增強(qiáng)GSCs對放療的敏感性。平板克隆形成實驗的結(jié)果顯示,高劑量(20gy)或低劑量(0.25gy)60Co-γ射線輻照聯(lián)合rhBMP2,均能夠有效降低輻照后腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力,因此推測,rhBMP2能夠降低放射治療后GB的復(fù)發(fā)。
　　結(jié)論:
　　本研究中,我們建立了膠質(zhì)瘤細(xì)胞系干細(xì)胞培養(yǎng)簡單易行的新方法,成功篩選并培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系的干細(xì)胞克隆球。研究了rhBMP2蛋白對GSCs促進(jìn)分化的作用