miR-200c在CIK細胞誘導的胃癌細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：檢測細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-inducedkillercells，CIK）的主要效應細胞（CD3+CD56+T細胞）對胃癌細胞凋亡及miR-200c表達的影響，探討miR-200c在CIK細胞誘導的胃癌細胞凋亡中的作用。
　　方法：1.外周血中分離單個核細胞后加入IFN-γ（1000U/mL）培養(yǎng)24小時，然后加入anti-CD3（5μg/mL）和IL-2（700U/mL），每2~3天補加IL-2繼續(xù)培養(yǎng)1

2、4天。磁珠分選后的CD3+CD56+CIK細胞和胃癌細胞（MKN-45和BGC-803）以不同比例（5：1、10：1、20：1、40：1）培養(yǎng)不同時間（0、6、12、24小時）后WST法檢測胃癌細胞增殖，確定最適效靶比及最佳作用時間。
　　2.胃癌細胞分為對照、CIK組，培養(yǎng)12小時后流式細胞術檢測胃癌細胞凋亡，實時熒光定量RT-PCR檢測miR-200c表達；胃癌細胞分為對照、miR-CTL、miR-200cmimics組，同時

3、分為對照、miR-200cinhibitor、CIK、CIK+miR-200cinhibitor組，培養(yǎng)12h后流式細胞術檢測凋亡。
　　3.構建包含miR-200c作用位點的psiCHECK2-FAP-13'-UTR，轉染胃癌細胞48h后加入CIK細胞，培養(yǎng)12小時后雙熒光素酶系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。胃癌細胞分為對照、miR-CTL、miR-200cmimics組，同時分為對照、miR-200cinhibitor、CIK、CIK+

4、miR-200cinhibitor組，培養(yǎng)12h后westernblot檢測FAP-1表達。
　　4.胃癌細胞分為對照、CIK組，RT-PCR和Westernblot分別檢測CIK細胞作用后胃癌細胞FAP-1基因及蛋白表達。胃癌細胞分為對照、CIK、CIK+FAP-1-siRNA，培養(yǎng)后12小時后流式細胞術檢測胃癌細胞凋亡。
　　結果：1.CD3+CD56+CIK細胞比例培養(yǎng)14天后由（1.29％±0.37%）上升為（32.

5、3%±3.76%（P<0.01），純度為92.34%。CIK細胞以時間、濃度依賴方式殺傷胃癌細胞，在12小時（P<0.05）和效靶比20：1時（P<0.05）作用顯著。2.與對照組（MKN-45：3.56%±0.81%，BGC-803：2.70%±0.71%）相比，CIK作用后胃癌細胞凋亡率顯著升高（MKN-45：22.08%±2.10%，P<0.05；BGC-803：21.28%±2.21%，P<0.05），miR-200c表達升高（

6、MKN45細胞：2.10±0.25倍，P<0.05；BGC-803細胞：1.87±0.11倍，P<0.05），miR-200cmimics能夠誘導胃癌細胞凋亡（P<0.05），而miR-200cinhibitor能夠拮抗CIK細胞對胃癌細胞凋亡誘導作用（MKN45細胞：40.11%±6.56%，BGC-803細胞：61.73%±5.27%）。3.miR-200c直接作用于FAP-1基因3'-UTR區(qū)，與對照組相比，CIK細胞降低胃癌細胞

7、熒光素酶活性（MKN-45細胞：49.67%±2.36%，P<0.01；BGC-803細胞：43.86%±4.41%，P<0.01）。miR-200cmimics抑制胃癌細胞FAP-1表達（P<0.05），而miR-200cinhibitor能夠拮抗CIK細胞對FAP-1下調作用（P<0.05）。
　　4.與對照組相比，CIK細胞下調胃癌細胞FAP-1基因（MKN-45：58.59%±1.23%，BGC-803：65.39%±1.

8、57%）及蛋白（MKN-45：46.86%±1.16%；BGC-803：45.38%±6.48%）表達，CIK細胞通過抑制FAP-1（P<0.05）促進胃癌細胞凋亡（P<0.01）。
　　結論：1.CIK細胞對胃癌細胞具有抗增殖及誘導凋亡作用。
　　2.CIK細胞通過上調胃癌細胞的miR-200c表達，作用于靶基因FAP-1的3'-UTR，抑制FAP-1表達，促進胃癌細胞凋亡。
　　3.CIK細胞是一種能夠對胃癌細胞具