BEX1拮抗BCL-2促進Imatinib誘導的細胞凋亡.pdf

1、研究背景：
　　靶向抑制酪氨酸激酶活性的甲磺酸伊馬替尼(Mesylate Imatinib，Imatinib)是目前臨床治療慢性粒細胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)和胃腸間質瘤(Gastrointestinal stromal tumors，GISTs)的一線藥物。然而，經Imatinib治療的約33％的慢性CML患者和約50％的GISTs患者由于逐漸出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥而導致病情進展。目前

2、認為Imatinib繼發(fā)性耐藥的主要機制包括兩大類:Breakpoint cluster region/Abelson tyrosine kinase(BCR/ABL)依賴性耐藥和BCR/ABL非依賴性耐藥。BCR/ABL依賴性耐藥主要原因包括:基因突變導致Imatinib與靶蛋白BCR/ABL的親和力降低，基因擴增導致BCR/ABL表達增加。BCR/ABL非依賴性耐藥主要是由于藥物轉運蛋白表達增加降低細胞內Imatinib有效濃度降低

3、所致。此外，腫瘤細胞抗凋亡能力增加也是BCR/ABL非依賴性耐藥的一個重要機制。
　　在先前的研究中，我們通過逐漸增加培養(yǎng)基中Imatinib藥物濃度的方法建立了一個Imatinib耐藥的K562細胞系KR。DNA測序發(fā)現(xiàn)KR細胞中BCR/ABL基因外顯子沒有任何新的基因突變。與K562細胞相比，KR細胞BCR/ABL的mRNA表達和蛋白水平均沒有明顯增加。上述結果提示KR細胞對Imatinib耐藥是一種BCR/ABL非依賴性的耐

4、藥。進一步分析發(fā)現(xiàn)藥物轉運蛋白家族中僅ABCB1有一定程度的升高，且高表達ABCB1已被證實對保護Imatinib誘導的K562細胞凋亡作用較弱。我們推測KR細胞的耐藥與其抗凋亡能力增強密切相關。那么有哪些（個）基因參與了KR細胞的凋亡抑制呢？
　　在分析K562細胞和KR細胞基因表達差異時發(fā)現(xiàn)，一個小分子的信息傳導分子，BEX1(Brain expressed X-linked1)在KR細胞中出現(xiàn)了最顯著的轉錄“沉默”，與K56

5、2細胞比較，BEX1在KR細胞中下降了千余倍，并且在隨后有/無Imatinib存在下經數(shù)十次的傳代后BEX1也無明顯增加。重新表達BEX1可顯著增加KR細胞的凋亡恢復對Imatinib的敏感性，提示KR細胞在耐藥過程中通過沉默BEX1而抑制Imatinib介導的細胞凋亡。目前對BEX1誘導細胞凋亡的分子機制尚不明了。因此，闡明BEX1介導的細胞凋亡信號傳導通路，可為明確Imatinib的耐藥機制，逆轉Imatinib耐藥提供新的靶點和思

6、路。
　　研究方法：
　　本課題主要從蛋白質相互作用角度出發(fā)，篩選與BEX1相互作用的蛋白質，探索BEX1及其靶蛋白相互作用的生理功能及下游信號通路，從而闡明BEX1誘導細胞凋亡的機制。首先采用酵母雙雜交技術從穩(wěn)定過表達BEX1蛋白的KR細胞系KR/BEX1的cDNA文庫中篩選與BEX1相互作用的靶蛋白，然后用免疫共沉淀技術鑒定BEX1與靶蛋白的結合能力，細胞熒光技術分析BEX1與靶蛋白的空間共定位。結合生物信息學分析，構建

7、BEX1不同氨基酸序列缺失的突變體，免疫共沉淀技術深入分析并明確BEX1與靶蛋白結合的具體位點。將結合域缺失的BEX1突變體，與野生型的BEX1分別轉染KR細胞，對比二者誘導凋亡能力的差別，明確BEX1和靶蛋白的結合與BEX1誘導細胞凋亡的關系。繼而采用蛋白質免疫印跡、流式細胞分析等技術，進一步分析BEX1與靶蛋白的結合啟動的細胞凋亡信號通路。本課題不僅對BEX1誘導細胞凋亡的信號通路有所闡明，而且為明確Imatinib耐藥分子機制及逆

8、轉耐藥提供了新的思路。
　　研究結果：
　　1.BCL-2(B-cell lymphoma2)是BEX1的結合蛋白。
　　采用酵母雙雜交技術，從穩(wěn)定過表達BEX1蛋白的KR細胞(KR/BEX1) cDNA文庫中篩選并初步鑒定出BCL-2是BEX1的靶蛋白。將BEX1轉染HEK293細胞，進一步用免疫共沉淀技術確認BEX1可以和BCL-2相互作用。
　　2.BEX1部分定位于BCL-2主要分布的細胞器-線粒體。

9、r>　　把BEX1的編碼序列分別插入到GFP(Green fluorescent protein)蛋白序列的N端和C端，構建BEX1與GFP融合蛋白的表達載體。以GFP蛋白為對照，分別觀察融合于GFP蛋白N端BEX1蛋白(BEX1-GFP)、或融合于GFP蛋白C端的BEX1蛋白(GFP-BEX1)在線粒體的定位情況。將GFP-BEX1或BEX1-GFP分別瞬時轉染KR細胞，將線粒體用特異性染料Mito-Tracker標記，激光共聚焦顯微

10、鏡發(fā)現(xiàn)GFP-BEX1和BEX1-GFP熒光均可部分定位于線粒體。應用差速離心法分離純化細胞線粒體，線粒體蛋白免疫印跡結果與熒光定位完全一致，BEX1與GFP的融合蛋白GFP-BEX1或BEX1-GFP均能定位于線粒體。綜上，BEX1部分定位于BCL-2主要分布的細胞器-線粒體。
　　3.33K-64Q是BEX1與BCL-2結合及線粒體定位的重要結構域。
　　采用分段克隆BEX1的辦法，構建了BEX1一系列的不同肽段缺失突變

11、體，分別轉染HEK293細胞。通過各種缺失突變體與BCL-2免疫共沉淀實驗分析，發(fā)現(xiàn)BEX1的33K-64Q肽鏈對與BCL-2的結合起著關鍵的作用。含有33K-64Q肽鏈的各種BEX1突變體能與BCL-2結合，而缺失33K-64Q肽鏈的BEX1失去了與BCL-2結合的能力。構建33K-64Q結合結構域缺失的BEX1Δ33K-64Q與GFP的融合蛋白，分別瞬時轉染KR細胞，細胞熒光定位分析和線粒體蛋白免疫印跡均發(fā)現(xiàn)BEX1缺失了33K-6

12、4Q肽鏈后，不再定位于線粒體。因此，33K-64Q是BEX1與BCL-2結合及BEX1線粒體定位的重要結構域。
　　4.BEX1與BCL-2的相互作用促進Imatinib誘導細胞凋亡。
　　采用流式細胞分析技術，對比瞬時表達BEX1和BEX1Δ33K-64Q誘導細胞凋亡的功能。在沒有Imatinib誘導KR細胞凋亡時，表達BEX1或BEX1Δ33K-64Q的KR細胞凋亡水平均沒有明顯變化。予以Imatinib誘導凋亡24小時

13、后，表達BEX1的KR細胞凋亡顯著增加，而表達BEX1Δ33K-64Q蛋白的KR細胞凋亡沒有明顯變化，然而合用一種可與BCL-2結合的小分子化合物ABT-737后，表達BEX1Δ33K-64Q的KR細胞凋亡率又顯著上升，說明BEX1促進Imatinib誘導的細胞凋亡與其和BCL-2的結合顯著相關。綜上，BEX1與BCL-2相互作用促進Imatinib誘導KR細胞凋亡。
　　5.BEX1與BCL-2的結合抑制BCL-2 Ser70的

14、磷酸化，促進BCL-2/BAX聚合體的解離，BAX部分敲除可逆轉BEX1誘導的細胞凋亡。
　　BCL-2主要通過調節(jié)蛋白表達水平，蛋白磷酸化以及與BAX等蛋白的寡聚化來調控細胞凋亡。因此，我們分別研究了BEX1與BCL-2結合后，BCL-2這三方面的變化情況。在KR細胞分別瞬時轉染BEX1和BEX1Δ33K-64Q48小時后，加入2uM Imatinib誘導細胞凋亡24小時，蛋白分析發(fā)現(xiàn)BCL-2總蛋白水平在兩組中沒有明顯差別，而

15、Ser70磷酸化的BCL-2蛋白在轉染BEX1的KR細胞中降低了近一半。免疫共沉淀分析顯示，轉染BEX1后，KR細胞中BCL-2與促凋亡蛋白BAX的結合沒有檢測到，而轉染BEX1Δ33K-64Q的KR細胞中，BCL-2與BAX的結合沒有明顯變化。將BAX shRNA和BEX1共同瞬時轉染KR細胞，加入2uM Imatinib誘導細胞凋亡24小時，流式細胞分析發(fā)現(xiàn)BAX表達降低可以削弱BEX1誘導細胞凋亡的能力。
　　研究結論：