Wnt5a基因敲除小鼠腭裂發(fā)生的機(jī)制研究.pdf

1、腭裂是一種常見(jiàn)的先天性畸形，因其影響因素十分復(fù)雜，發(fā)生機(jī)制目前仍未明確。近年來(lái)一些研究表明，腭中嵴上皮細(xì)胞(MEE)、腭突間充質(zhì)細(xì)胞(EPM)以及舌體細(xì)胞的增殖和凋亡對(duì)腭的正常發(fā)育具有重要作用，與腭裂的形成密切相關(guān)。Wnt5a是Wnt信號(hào)分子家族中唯一在上皮和間充質(zhì)中均有表達(dá)的成員，并且經(jīng)由Wnt/Ca2+信號(hào)通路在胚胎的發(fā)育過(guò)程中起到調(diào)控作用。以往的研究證實(shí)Wnt5a基因敲除小鼠全部外向型生長(zhǎng)的組織，包括上下頜骨、四肢、尾以及生殖器等

2、均發(fā)育不良，并且存在初級(jí)胚胎A-P體軸延展不足。其機(jī)制主要是Wnt5a基因敲除導(dǎo)致進(jìn)展區(qū)細(xì)胞增殖水平的下降。目前，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道Wnt家族成員的Wnt5a基因敲除小鼠口腔頜面部尤其是腭部的發(fā)育異常。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)Wnt5a基因敲除小鼠胚胎頜面部進(jìn)行冠狀面連續(xù)切片，觀察其繼發(fā)腭的形態(tài)；利用BrdU標(biāo)識(shí)法和TUNEL染色，研究側(cè)腭突細(xì)胞以及舌體細(xì)胞在腭突融合期的細(xì)胞增殖和凋亡水平，來(lái)探索Wnt5a基因敲除小鼠腭裂發(fā)生的機(jī)制。

3、 目的： 本課題應(yīng)用Wnt5a基因敲除小鼠，通過(guò)觀察細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡在腭部發(fā)育和腭裂發(fā)生中表達(dá)水平和分布的改變，探究Wnt5a信號(hào)分子對(duì)頜面部尤其是腭部發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。 方法： 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的Wnt5a基因敲除雜合子成鼠由美國(guó)Harvard大學(xué)的Dr.McMahon實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予，飼養(yǎng)在美國(guó)南加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，將陰栓陽(yáng)性的孕鼠記為妊娠0天(gestation day 0，GD0)全部孕鼠分別于GD14

4、、GD 15和GD18上午10時(shí)處死，處死前20分鐘均按100mg/kg體重腹腔注射BrdU。分離Wnt5a基因敲除和正常對(duì)照鼠胚，4％多聚甲醛固定，系列脫水，包埋，5μm冠狀面連續(xù)切片用于HE染色、BrdU標(biāo)識(shí)和TUNEL標(biāo)記。 結(jié)果： 與正常對(duì)照組相比，Wnt5a基因敲除小鼠胚胎表現(xiàn)如下：1、口腔頜面部形態(tài)學(xué)上的明顯異常，主要為上下頜短縮、舌異常隆起并且未能下降、側(cè)腭突短縮并缺乏水平上抬而形成腭裂。2、BrdU染色結(jié)

5、果顯示腭突融合期的腭間充質(zhì)細(xì)胞以及舌上皮與間充質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞率與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，而在腭正中嵴上皮卻未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。3、TUNEL標(biāo)識(shí)法結(jié)果顯示腭突間充質(zhì)細(xì)胞、舌背上皮細(xì)胞及舌體間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生異常增多的TUNEL陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞，而在腭正中嵴上皮卻未發(fā)現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論： 1、Wnt5a基因敲除小鼠口腔頜面部發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為腭裂和舌形態(tài)及位置異常。 2、Wnt5a基因敲除小鼠腭裂