經腦室少突膠質祖細胞移植對腦室周圍白質軟化大鼠髓鞘修復的研究.pdf

1、[目的] 通過熒光標記的體外培養(yǎng)獲得少突膠質細胞/II型星形膠質祖細胞(oligodendrocyte/type II astrocyte，O2A祖細胞，也稱少突膠質祖細胞)，經側腦室移植到新生大鼠腦室周圍白質軟化模型(periventricular lerkomalacia，PVL)上。通過Western blot技術、實驗動物認知評價對經側腦室移植O2A祖細胞的PVL模型大鼠進行評估。為干細胞移植治療少突膠質細胞損傷后髓鞘形

2、成障礙或脫髓鞘疾病的研究提供實驗依據。 [方法] 1.采用兩次恒溫搖床振蕩分離純化法和條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲取大鼠少突膠質祖細胞。免疫熒光染色法鑒定細胞類型并判斷純度。 2.通過對3日齡新生SD大鼠進行雙側頸總動脈結扎的方法，建立腦室周圍白質軟化新生大鼠動物模型。并用組織病理學，少突膠質前體細胞凋亡檢測，實驗動物生長發(fā)育及神經行為學等方法對動物模型評價。 3.體外培養(yǎng)獲得O2A祖細，并在成功創(chuàng)建了新生大鼠

3、腦室周圍白質軟化模型的基礎上，對建模后72h的PVL新生大鼠進行經側腦室O2A祖細胞移植治療。 通過Western blot技術、實驗動物認知評價對經側腦室移植O2A祖細胞的PVL模型大鼠進行評估。 [結果] 1.從新生SD大鼠皮層分離的O2A祖細胞胞體呈圓形，常有單極或雙極突起，形成克隆球，A285標記陽性，免疫熒光鑒定細胞純度可達95％。體外培養(yǎng)時O2A細胞具有雙向分化的能力，在不同誘導條件下可分化為星型膠質

4、細胞或少突膠質細胞。 2.對3日齡新生SD大鼠進行雙側頸總動脈結扎后，模型組與對照組大鼠相比，模型組大鼠生長緩慢，睜眼時間延遲，懸崖逃避能力及雙臂懸吊能力均降低，差異有統計學意義。在水迷宮實驗中，模型組大鼠在水中尋找站臺的游泳速度減慢、尋找站臺的所用的時間延長(即模型組的平均逃避潛伏期比對照組延長)、撤去平臺后在平臺所在象限停留時間縮短(即模型組第三象限停留時間比對照組縮短)。 3.腦組織HE染色，模型組術后24小時、4

5、8小時可見彌散性皮質下和腦室周白質疏松水腫。術后1周模型組腦白質水腫明顯減輕，但腦白質疏松，組織結構層次與對照組相比不清晰。術后3周時模型組腦白質膠質細胞增生形成膠質結節(jié)。術后4周時模型組腦白質膠質細胞消失，形成網格狀的軟化灶。 4.激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，模型組術后側腦室周O4和TUNEL雙陽性。結果說明模型所致腦白質損傷主要以O4陽性的少突膠質前體細胞為主。 5.O2A祖細胞移植后水迷宮實驗顯示PVL+O2A祖細胞

6、移植組大鼠水中尋找平臺的游泳速度較快、尋找平臺的所用的時間比PVL+PBS組、PVL組縮短縮短，撤去平臺后在平臺所在象限停留時間比PVL+PBS組、PVL組延長。 6.Western blot半定量技術檢測PVL+O2A祖細胞移植組、PVL+PBS組PVL組三組鼠腦白質MBP表達量，顯示PVL組和PVL+PBS組在移植后7、14、28天即P13、P20、P34大鼠腦白質MBP表達量均低于同齡PVL+O2A祖細胞移植組。PVL組與

7、PVL+PBS組在移植后7、14、28天即P13、P20、P34大鼠腦白質MBP表達量相比無差異。 [結論] 1.采用兩次恒溫搖床振蕩分離純化法和條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)，可獲取高純度的大鼠少突膠質祖細胞。 2.通過對3日齡新生SD大鼠進行雙側頸總動脈結扎的方法，可建立與人類早產兒腦室周圍白質軟化病理相似的腦室周圍白質軟化動物模型。 3.移植的O2A祖細胞可以促進損傷髓鞘的修復。間接提示移植的O2A祖細胞可分化