miRNA-26a經(jīng)由USP3介導(dǎo)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用.pdf

1、目的:探討經(jīng)由USP3介導(dǎo),miR-26a對(duì)小鼠正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞增殖過(guò)程的差異調(diào)控,闡明miR-26a通過(guò)其靶基因USP3抑制肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,為USP3作為肝癌細(xì)胞基因治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠正常肝細(xì)胞(BNL CL.2)和肝癌細(xì)胞(Hepa1-6)miR-26a和 USP3的表達(dá)水平,以及臨床肝癌和癌旁組織病例標(biāo)本中miR-26a和USP3的表達(dá)水平。

2、　　2.雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證USP3是miR-26a的直接靶基因。
　　3.小鼠正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物以及抑制USP3的慢病毒后,用CCK8比色測(cè)定法和3H-TdR同位素?fù)饺敕z測(cè)小鼠正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖情況。
　　4. Western blot法檢測(cè)USP3以及PCNA,MDM2,Cdc25C,Chk1等相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-26a

3、表達(dá)水平在小鼠正常肝細(xì)胞中比肝癌細(xì)胞高,USP3表達(dá)水平與miR-26a趨勢(shì)相反。
　　2.通過(guò)生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)miR-26a在USP3-3'UTR有一段7個(gè)堿基完全互補(bǔ)配對(duì)。為了驗(yàn)證USP3是miR-26a的直接靶基因,我們構(gòu)建了含USP3-3'UTR野生型及突變型的報(bào)告基因質(zhì)粒,通過(guò)雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-26a可顯著抑制USP3-3'UTR野生型報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性而對(duì)突變型無(wú)顯著影

4、響。
　　3.對(duì)小鼠正常肝細(xì)胞BNL CL.2和肝癌細(xì)胞Hepa1-6分別轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物(miR-26a mimics)和抑制USP3的慢病毒(LV-shUSP3)后,小鼠正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖均受到抑制,但對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的抑制增殖作用更為明顯。
　　4.Western blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示,小鼠正常肝細(xì)胞BNL CL.2在轉(zhuǎn)染miR-26a mimics或LV-shUSP3后,USP3和MDM2蛋白表達(dá)量

5、明顯降低,PCNA蛋白表達(dá)量增加,Cdc25C,Chk1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化;小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6在轉(zhuǎn)染miR-26a mimics或LV-shUSP3后,USP3和MDM2蛋白表達(dá)量明顯降低,PCNA,Cdc25C,Chk1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.USP3是miR-26a的直接靶基因。
　　2.miR-26a通過(guò)靶向調(diào)節(jié)USP3抑制小鼠正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖,并且對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用更為