神經(jīng)毒素誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元凋亡與分泌粒蛋白Ⅲ表達(dá)失調(diào)的相關(guān)性研究.pdf

1、帕金森病(parkinson's disease，PD)是發(fā)生在中老年常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病變?cè)诤谫|(zhì)紋狀體通路，顯微鏡下可見(jiàn)黑質(zhì)致密部(substantia nigra parscompacta，SNpc)大量多巴胺能神經(jīng)元凋亡，殘留的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中圓形嗜酸性Lewy包涵小體形成。PD發(fā)病多種因素參于其中，遺傳因素可使患病易感性增加，而在環(huán)境因素及衰老的相互作用下，導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡加速，多巴胺(dopamine，D

2、A)合成減少，出現(xiàn)一系列PD的癥狀。近年來(lái)，大量流行病學(xué)及病例.對(duì)照研究揭示，許多環(huán)境毒素諸如殺蟲(chóng)劑、除草劑等可引起大腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡，長(zhǎng)期接觸可引發(fā)PD；而做為腦內(nèi)正常神經(jīng)遞質(zhì)之一的DA，一旦其在胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞外間隙的游離形式升高同樣可導(dǎo)致細(xì)胞損傷。在PD的治療方面，針對(duì)患者體內(nèi)紊亂的神經(jīng)內(nèi)分泌環(huán)境，以逆轉(zhuǎn)多巴胺能與膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)失衡為根本目的的醫(yī)療手段前景可觀。
　　 分泌粒蛋白Ⅲ(secretograninⅢ，SCG

3、3/SgⅢ)是分泌粒家族(granin family)中一個(gè)較新的成員，其生物學(xué)特性、病理生理學(xué)及臨床意義日益受到關(guān)注。SCG3廣泛分布于內(nèi)分泌腺體、神經(jīng)內(nèi)分泌組織與神經(jīng)系統(tǒng)。大量研究已經(jīng)表明，在反面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(trans-Golgi network，TGN)，SCG3對(duì)具有生物活性的肽類(lèi)與胺類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行組裝、靶向輸送以及后續(xù)的分泌顆粒形成發(fā)揮著重要作用。SCG3在代謝性疾病(病理性肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化)，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(小細(xì)胞

4、型肺癌、前列腺癌)以及由雌激素代謝失調(diào)引起的內(nèi)分泌紊亂等方面的研究已有報(bào)道，其病理生理學(xué)意義主要體現(xiàn)在對(duì)體內(nèi)胺類(lèi)及肽類(lèi)物質(zhì)的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)并參與調(diào)節(jié)釋放過(guò)程。鑒于SCG3廣泛且特異的分布特征及特有的生物學(xué)功能，該蛋白已經(jīng)成為研究哺乳動(dòng)物內(nèi)分泌腺體及中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌顆粒分布特征最具價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)記，并對(duì)神經(jīng)與精神疾病、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及其他代謝性疾病的診斷、療效及預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
　　 Caspase家族凋亡效應(yīng)組成員c

5、aspase-3、-6、-7具有相似的功能和相近的底物特異性，激活后能極為有效的水解維持細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)和重要功能的蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。對(duì)caspase酶切底物的研究，將有助于闡明caspase依賴(lài)途徑致細(xì)胞凋亡的機(jī)制。研究caspase介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞中SCG3基因與蛋白表達(dá)量變化及其相關(guān)的分子機(jī)制，證實(shí)SCG3在細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所充當(dāng)?shù)慕巧?，有助于?duì)其生物學(xué)功能深入研究并探究其參與PD發(fā)病的機(jī)制。以中國(guó)北方漢族健康人群與P

6、D患者血樣為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行病例-對(duì)照研究，對(duì)SCG3基因編碼區(qū)錯(cuò)義突變及框移突變進(jìn)行等位基因多態(tài)性調(diào)查，并研究單核苷酸位點(diǎn)與PD的相關(guān)性，將為整體研究SCG3基因及其與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)性提供有價(jià)值的資料。
　　 在多巴胺能神經(jīng)元中，關(guān)于神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白功能失調(diào)與PD關(guān)系的研究尚不多見(jiàn)。因此，深入研究神經(jīng)毒素對(duì)多巴胺能神經(jīng)元以及神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的作用，對(duì)于明確PD發(fā)病機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)選擇具有神經(jīng)內(nèi)分泌及神經(jīng)元

7、特性的SH-SY5Y細(xì)胞作為研究對(duì)象，以常用農(nóng)業(yè)除草劑百草枯(paraquat，PQ)做為外源性毒素，腦內(nèi)正常神經(jīng)遞質(zhì)DA做為內(nèi)源性毒素，檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞在兩種不同神經(jīng)毒素單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)pro-Casp-3表達(dá)變化及可能的作用底物，深入研究神經(jīng)毒素致多巴胺能細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制。研究在細(xì)胞凋亡模型下SCG3基因及蛋白水平表達(dá)量變化及其相關(guān)的分子機(jī)制，證實(shí)SCG3在細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所充當(dāng)?shù)慕巧M(jìn)而探究其參與PD發(fā)病的機(jī)制

8、，以期為PD的預(yù)防及有效治療尋找新的靶點(diǎn)。
　　 材料與方法：
　　 1、MTT法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)PQ和/或DA誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖與存活率變化，倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)毒素誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；
　　 2、蛋白免疫印跡檢測(cè)PQ和/或DA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)pro-Casp-3及PARP的表達(dá)變化，分析神經(jīng)毒素是否可通過(guò)caspase-3依賴(lài)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡；
　　 3、半定量PCR與熒光實(shí)

9、時(shí)定量PCR分析PQ誘導(dǎo)前后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)SCG3mRNA表達(dá)變化；
　　 4、蛋白免疫印跡分析PQ誘導(dǎo)前后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)及分泌出胞的SCG3蛋白量變化，以及z-VAD-fmk對(duì)PQ誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞中SCG3蛋白表達(dá)影響；
　　 5、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)SCG3蛋白與CgA蛋白的相互作用，并分析PQ誘導(dǎo)前后SCG3蛋白亞細(xì)胞分布的改變；
　　 6、采用人重組caspase-3、-6、-7

10、酶切外源性SCG3蛋白(HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的SCG3基因完整編碼區(qū)重組質(zhì)粒)及內(nèi)源性SCG3蛋白(未處理的SH-SY5Y細(xì)胞)，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SCG3蛋白是否可被caspase酶切；
　　 7、重疊延伸PCR構(gòu)建SCG3基因定點(diǎn)突變體，采用人重組caspase-3、-6、-7酶切外源性SCG3蛋白(HEK293細(xì)胞中突變的SCG3基因重組質(zhì)粒)，體外實(shí)驗(yàn)鑒定SCG3蛋白序列上caspase酶切位點(diǎn)；
　　 8、收集中

11、國(guó)北方漢族PD患者與健康人血液樣本，酚-氯仿法提取基因組DNA，PCR-RFLP法對(duì)SCG3編碼區(qū)可導(dǎo)致框移突變或錯(cuò)義突變的單核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行等位基因多態(tài)性調(diào)查，并驗(yàn)證與PD的相關(guān)性；
　　 9、轉(zhuǎn)染包含錯(cuò)義突變的SCG3重組質(zhì)粒，蛋白免疫印跡檢測(cè)錯(cuò)義突變對(duì)SCG3蛋白表達(dá)量的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、PQ和/或DA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，細(xì)胞增殖被抑制且存活率下降，其中以毒素聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞最為明顯，提示二

12、者的神經(jīng)毒性具有協(xié)同作用。毒素誘導(dǎo)后存活細(xì)胞形態(tài)變化顯著，可見(jiàn)細(xì)胞胞體皺縮，神經(jīng)突縮短甚至消失。
　　 2、PQ和/或DA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)pro-Casp-3含量明顯降低且伴隨部分PARP酶切，表明二者單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞后均以caspase-3依賴(lài)方式致細(xì)胞凋亡。caspase廣譜抑制劑z-VAD-fmk可有效阻滯PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞內(nèi)pro-Casp-3含量明顯恢復(fù)。
　　 3、PQ誘導(dǎo)的SH-SY5

13、Y凋亡細(xì)胞內(nèi)，SCG3 mRNA及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，其中以蛋白水平變化最為顯著，而z-VAD-fmk可有效阻滯凋亡細(xì)胞中SCG3蛋白表達(dá)量降低。
　　 4、DA誘導(dǎo)的SH-SY5Y凋亡細(xì)胞內(nèi)，SCG3蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降，表現(xiàn)出與PQ誘導(dǎo)后SH-SY5Y細(xì)胞相似的結(jié)果。
　　 5、在SH-SY5Y細(xì)胞胞漿中，SCG3蛋白呈顆粒狀均勻分布于整個(gè)胞漿及神經(jīng)突中，并與其家族成員CgA相互結(jié)合形成復(fù)合物。

14、>　　 6、對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)SCG3蛋白的分布及表達(dá)量進(jìn)行定性與定量研究發(fā)現(xiàn)，SCG3蛋白在SH-SY5Y細(xì)胞胞漿中表達(dá)豐富，經(jīng)過(guò)PQ誘導(dǎo)后，SCG3蛋白顆粒似乎僅分布在核周，且蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降。
　　 7、在生理狀態(tài)下及神經(jīng)毒素誘導(dǎo)后，SH-SY5Y細(xì)胞可將胞漿中部分SCG3蛋白分泌致細(xì)胞外間隙。
　　 8、在體外實(shí)驗(yàn)研究中，轉(zhuǎn)染SCG3基因完整編碼區(qū)重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞以及未處理的SH-SY

15、5Y細(xì)胞，均可檢測(cè)到分子量約為68 kDa的SCG3完整蛋白；將上述細(xì)胞蛋白經(jīng)人重組caspase-3、-7作用后，分子量為68 kDa的SCG3蛋白經(jīng)酶切后可觀測(cè)到一分子量約為40 kDa的蛋白片段。然而，caspase-6不能酶切SCG3蛋白。
　　 9、在體外實(shí)驗(yàn)研究中，轉(zhuǎn)染引入定點(diǎn)突變的SCG3基因重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，可檢測(cè)到分子量約為68 kDa的SCG3完整蛋白，而人重組caspase-3、-6、-7不能將該

16、蛋白酶切。
　　 10、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)，僅可見(jiàn)分子量為68 kDa的SCG3蛋白降低，但未觀察到明確的降解片段。
　　 11、SH-SY5Y細(xì)胞SCG3基因完整編碼區(qū)測(cè)序及病例-對(duì)照研究鑒定出2個(gè)新的點(diǎn)突變，分別為254 A/-與1033 A/G。對(duì)疾病組與對(duì)照組的基因型數(shù)據(jù)分析顯示，254A/-與1033A/G在疾病組中各檢出2例雜合子，在對(duì)照組中各檢出1例雜合子；而已報(bào)道的rs358

17、83815位點(diǎn)在本次調(diào)查的300例樣本中未檢出。三個(gè)單核苷酸位點(diǎn)與PD均沒(méi)有明顯的相關(guān)性。
　　 12、含有1033G點(diǎn)突變的SCG3重組質(zhì)粒較含有1033A位點(diǎn)的SCG3重組質(zhì)粒蛋白表達(dá)量下降。
　　 結(jié)論：
　　 1、PQ與DA均可抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖，且二者的神經(jīng)毒性具有協(xié)同作用，均以caspase-3依賴(lài)方式致細(xì)胞凋亡。
　　 2、PQ或DA誘導(dǎo)的SH-SY5Y凋亡細(xì)胞內(nèi)，SCG3基因及蛋白

18、表達(dá)水平均顯著下降。
　　 3、在多巴胺能細(xì)胞SH-SY5Y胞漿中SCG3蛋白與CgA蛋白形成復(fù)合物，且該細(xì)胞可將部分SCG3蛋白分泌至細(xì)胞外，而經(jīng)PQ誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞中SCG3蛋白的亞細(xì)胞分布改變明顯，即多為核周分布。
　　 4、SCG3蛋白存在著caspase-3、-7的酶切識(shí)別序列，在第136位與第137位氨基酸之間為酶切位點(diǎn)，但SCG3蛋白不能被caspase-6酶切。
　　 5、SCG3基因編碼區(qū)254A