RNA干擾α-突觸核蛋白對多巴胺能神經(jīng)元的影響及其機(jī)制.pdf

1、帕金森病是最早出James Parkinson醫(yī)生于1817年報告并因此而得名的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其臨床癥狀有靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直、隨意運動減少和正常的姿勢平衡反射喪失等。
　　 PD的病因尚不清楚，目前認(rèn)為與線粒體功能異常、氧化應(yīng)激等因素密切相關(guān)。Schapira等首次報道PD病人的黑質(zhì)內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性降低，大量的文獻(xiàn)報道PD病人的血小板、淋巴細(xì)胞及肌肉組織內(nèi)都存在線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性降低。因此PD的發(fā)病伴隨著線

2、粒體功能異常。而且用復(fù)合物Ⅰ的抑制劑魚藤酮處理后，動物表現(xiàn)出PD樣行為學(xué)改變，并且黑質(zhì)紋狀體內(nèi)出現(xiàn)類似PD的病理變化。研究表明PD病人細(xì)胞內(nèi)的氧化產(chǎn)物如活性氧簇增多，而抗氧化物如谷胱苷肽水平降低，引起PD病人的黑質(zhì)內(nèi)多不飽和脂肪酸的濃度下降、脂質(zhì)氧化的標(biāo)志物丙二醛和4-羥基壬烯醛濃度升高、可溶性蛋白的羰基修飾水平明顯提高并且PD病人腦內(nèi)細(xì)胞核DNA和線粒體DNA中的脫氧鳥苷被氧化成8-羥脫氧鳥苷，這表明PD病人腦內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA

3、都處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　 PD的主要病理變化包括黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元死亡和殘留神經(jīng)元胞漿內(nèi)蛋白積聚出現(xiàn)嗜酸性包涵體即路易小體。組織學(xué)發(fā)現(xiàn)LB的纖維成分主要由泛素、神經(jīng)絲和α-突觸核蛋白組成。α-突觸核蛋白是一種突觸前神經(jīng)末梢蛋白,其生理作用尚不明確。據(jù)報道它可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化、突觸可塑性和遞質(zhì)的釋放及參與某些信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。但α-突觸核蛋白基因SNCA的錯義點突變A53T、A30P、E46K都可以導(dǎo)致家族性帕金森病

4、癥狀。另外SNCA的二倍重復(fù)突變體和三倍重復(fù)突變體也可以引起早發(fā)性遺傳性帕金森癥狀，而且在三倍重復(fù)突變體家族比二倍重復(fù)突變體家族發(fā)病年齡早、進(jìn)程快，這說明α-突觸核蛋白表達(dá)量也與PD密切相關(guān)。許多文獻(xiàn)報道非家族性PD病人的腦內(nèi)也出現(xiàn)α-突觸核蛋白表達(dá)升高及蛋白的異常積聚。體內(nèi)和體外的研究也表明，過度表達(dá)α-突觸核蛋白會造成神經(jīng)元死亡。這些都提示α-突觸核蛋白在PD的發(fā)病中起重要作用，抑制其表達(dá)可能會阻止或延緩多巴胺能神經(jīng)元的死亡。

5、>　　 RNA干擾是一種在轉(zhuǎn)錄后水平有效抑制基因表達(dá)的方法。化學(xué)合成的小干擾RNA是一種常用的介導(dǎo)RNAi的雙鏈RNA，與載體攜帶的短發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)相比作用時間短暫、轉(zhuǎn)染率低。Fountaine等利用化學(xué)合成的siRNA可以減少α-突觸核蛋白表達(dá)并能抵抗1-甲基-4-苯基吡啶離子引起的細(xì)胞活性下降，但是否影響了細(xì)胞線粒體的功能、凋亡調(diào)控因子表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平未見報道。
　　 本研究用采用了分子克隆、基因沉默和細(xì)胞培養(yǎng)等技

6、術(shù)，構(gòu)建出靶向α-突觸核蛋白的shRNA重組質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。利用Mpp+制作PD細(xì)胞模型，利用RT-PCR、MTT分析、流式細(xì)胞分析和Westernblotting、DCFH-DA法等方法探討了干擾α-突觸核蛋白表達(dá)對帕金森病細(xì)胞模型的形態(tài)改變、線粒體的功能、Bcl-2/Bax表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)的ROS和GSH水平的影響。以期為PD的基因治療提供可靠的實驗依據(jù)，為PD的治療提供新思路。
　　 第一部分 RNA

7、i表達(dá)載體的構(gòu)建及沉默效應(yīng)的鑒定
　　 目的：應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建靶向α-突觸核蛋白基因的shRNA表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞系，鑒定其沉默基因的效果。
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建靶向α-突觸核蛋白基因的shRNA表達(dá)載體。根據(jù)表達(dá)載體的要求和文獻(xiàn)報道的有效siRNA的序列，設(shè)計合成插入載體的shRNA序列，以一對無關(guān)序列的寡核苷酸作為陰性對照。將單鏈DNA退火連接，并將退火片段與線性化的質(zhì)粒載體p

8、Genesil-2.2連接，形成重組質(zhì)粒pGenesil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選卡那霉素抗性的陽性克隆，提取質(zhì)粒。對構(gòu)建的表達(dá)載體質(zhì)粒pGenesil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA分別經(jīng)SalI酶切電泳鑒定及DNA測序。
　　 2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞系，鑒定基因沉默效果。將pGen

9、esil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA通過陽離子脂質(zhì)體的介導(dǎo)轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)，利用G418抗性篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了pGenesil-α-syn-shRNA的細(xì)胞為干擾組，轉(zhuǎn)染了pGenesil-scrambled shRNA的細(xì)胞作為載體對照組，未轉(zhuǎn)染任何載體的細(xì)胞為正常對照組。提取各組細(xì)胞蛋白，利用Western blotting檢測各組細(xì)胞中α-突觸核蛋白的表達(dá)水平。

10、　　 結(jié)果：
　　 1.構(gòu)建的表達(dá)載體pGenesil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA經(jīng)SalI酶切、瓊脂糖凝膠電泳后觀察到一條約620bp的條帶。DNA測序結(jié)果證實目的序列準(zhǔn)確無誤，與設(shè)計結(jié)果完全相符。
　　 2.經(jīng)G418篩選，可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的pGenesil-α-syn-shRNA與pGenesil-scrambled shRNA的陽性細(xì)胞。經(jīng)Western blotti

11、ng檢測，載體對照組的細(xì)胞與正常對照細(xì)胞α-突觸核蛋白的表達(dá)相似，而干擾組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的α-突觸核蛋白明顯降低。
　　 結(jié)論：靶向α-突觸核蛋白的表達(dá)載體pGenesil-α-syn-shRNA經(jīng)酶切鑒定及DNA測序證實構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以穩(wěn)定地干擾SH-SYSY細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白的表達(dá)。
　　 第二部分 RNA干擾α-突觸核蛋白對MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體功能障礙的抑制作用
　　 目的：研究RN

12、A干擾α-突觸核蛋白對MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙和Bcl-2/Bax下降的作用。
　　 方法：
　　 1.采用MTT法，檢測三組細(xì)胞：正常未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pGenesil-scrambled shRNA的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pGenesil-α-syn-shRNA的細(xì)胞在不含MPP+或含500μM MPP+的培養(yǎng)基中孵育24 h后的細(xì)胞活力。
　　 2.用Hoechst33258對細(xì)胞進(jìn)行染色，

13、觀察正常對照組或干擾組細(xì)胞在MPP+處理后細(xì)胞核的形態(tài)變化。
　　 3.用流式細(xì)胞技術(shù)檢測正常對照組或干擾組的細(xì)胞在MPP+處理后線粒體膜電位的變化。
　　 4.Western blotting檢測MPP+處理后正常對照組或干擾組細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素c和細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.MPP+處理24 h后正常對照組、載體對照組和干擾組細(xì)胞的活力都顯著降低，與MPP+處理的正常組細(xì)

14、胞相比，經(jīng)MPP+處理的載體對照組無顯著差異，而干擾組細(xì)胞能顯著抵抗MPP+引起的細(xì)胞活力下降。
　　 2.Hoechst33258染色顯示正常對照組細(xì)胞在MPP+處理24 h后有30.2+1.6％細(xì)胞核呈凋亡狀態(tài)，而干擾組細(xì)胞與MPP+共孵育后僅有14.2±1.3％細(xì)胞凋亡，與前者相比有明顯差異。
　　 3.MPP+作用后，正常對照組低線粒體膜電位的細(xì)胞占41.0±1.5％，在MPP+處理的干擾組此比例僅為13.6±1

15、.2％，兩者有顯著差異。
　　 4.MPP+引起細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c明顯升高，在干擾組細(xì)胞中這種升高明顯減弱。
　　 5.正常對照細(xì)胞在MPP+處理后Bcl-2/Bax比值僅為原來的35.5±3.8％，而干擾組細(xì)胞在MPP+處理后Bcl-2/Bax比值約為85.2±3.0％，比前者明顯升高。
　　 結(jié)論：干擾α-突觸核蛋白表達(dá)可能通過上調(diào)Bcl-2/Bax比值、抵抗線粒體膜電位下降、抑制線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c釋放進(jìn)胞

16、漿，從而保護(hù)線粒體的正常功能，抵抗MPP+引起的細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分 RNA干擾α-突觸核蛋白對MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的抑制作用
　　 目的：研究RNA干擾α-突觸核蛋白對MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS和GSH水平變化的影響作用。
　　 方法：
　　 1.將DCFH-DA裝載到細(xì)胞，利用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度來顯示細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。
　　 2.用GSH分析試

17、劑盒來檢測細(xì)胞內(nèi)的GSH水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.MPP+處理后，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高至正常對照組的234.7±3.8％，干擾組細(xì)胞經(jīng)MPP+處理后，ROS水平升高至149.2±8.2％，但與MPP+處理的正常對照細(xì)胞相比，ROS水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)500μM MPP+處理后，細(xì)胞內(nèi)的GSH水平降低為正常對照細(xì)胞內(nèi)的56.0±3.5％。干擾組細(xì)胞在M

18、PP+處理后，細(xì)胞內(nèi)的GSH水平為61.1±3.2％，與MPP+處理的正常對照細(xì)胞相比，GSH水平顯著升高。
　　 結(jié)論：干擾α-突觸核蛋白表達(dá)能抑制MPP+引起的ROS水平升高和GSH水平降低。這可能是干擾α-突觸核蛋白表達(dá)能抑制MPP+細(xì)胞毒性的一個原因。
　　 小結(jié)：
　　 本課題應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建的shRNA表達(dá)質(zhì)粒能有效地干擾SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白表達(dá)并可抑制MPP+引起的細(xì)胞凋亡和形態(tài)學(xué)