雛鴨感染DRV后炎性相關因子與脾損傷之間的動態(tài)關系.pdf

1、鴨呼腸孤病毒病是由鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus，DRV)引起的以脾表面出現(xiàn)黃白色壞死灶，法氏囊萎縮為主要特征的一種急性傳染病，該病毒可感染雛鴨和雞，繼發(fā)感染其他病原引起動物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失。目前關于哺乳動物脾損傷的機制研究已逐步深入，研究結果表明PKR在各種損傷過程中發(fā)揮著重要作用。但是關于鴨PKR介導的炎癥反應還未見報道，且是否參與DRV引起脾損傷的進程還不清楚。因此研究PKR在脾損傷中的作用是很有必要的。

2、本研究通過建立人工感染模型，探討PKR介導的炎癥信號通路在DRV感染雛鴨致脾損傷中的作用。主要包括以下幾個方面:
　　1.DuTNF-α多克隆抗體的制備
　　本實驗以雛鴨脾組織的RNA為模板，利用RT-PCR技術擴增DuTNF-α基因，克隆至pET-28a載體上，經(jīng)過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定測序分析正確后，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-DuTNF-α，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta中，在IPTG終濃度1mmol/L和37

3、℃條件下誘導4h，外源基因獲得高效表達。通過Ni柱對蛋白進行純化，純化后的DuTNF-α蛋白免疫新西蘭大耳白兔，經(jīng)三次免疫后取全血，分離得到DuTNF-α多克隆抗體。利用Elisa和免疫組織化學染色檢測結果表明多克隆抗體有較好的反應原性。
　　2.建立DRV感染7日齡櫻桃谷鴨模型
　　分別在雛鴨感染后1d、3d、5d、7d、14d剖殺取脾組織。從組織形態(tài)學判定脾損傷程度，采用組織病理學及免疫組織化學判定炎癥反應的產(chǎn)生。利用R

4、T-qPCR技術檢測感染后脾中PKR、MKK6、AP-1、IPS-1、NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表達量的動態(tài)變化，并分別取5個時間點實驗組和對照組的脾臟石蠟切片，每組各取三個重復樣品進行免疫組化，使用數(shù)字切片掃描儀將切片掃描，使用單位面積陽性率進行結果分析。
　　眼觀病變發(fā)現(xiàn)，感染后1d、3d脾顯著腫大，顏色逐漸加深，部分病灶呈暗黑色，感染5d后脾顏色恢復正常，脾表明可見明顯大小不一的黃白色病灶。組織病理學觀察結果發(fā)

5、現(xiàn)感染后3d脾出血嚴重，白髓淋巴細胞明顯減少，感染后5d脾臟可見明顯的壞死灶，壞死灶與周圍健康細胞分界明顯，感染7d后可見明顯的肉芽腫結構。根據(jù)Opriessning T的評定標準對脾組織學病理損傷進行評定發(fā)現(xiàn)感染3d后出血嚴重，感染5d后發(fā)生壞死，感染7d后形成肉芽腫結構。用DRV特異性抗體及炎癥細胞特異性抗體進行免疫組織化學染色，證明脾產(chǎn)生嚴重的炎癥反應。熒光定量檢測脾中PKR介導的炎癥信號通路相關因子的表達量，結果顯示PKR在感染

6、后1d、3d、5d處于上調(diào)表達，且5d達到峰值，7d、14d與5d試驗組相比差異顯著(P＜0.05)，這與病毒的表達量呈正相關，說明PKR可能參與dsRNA的識別，從而激活下游因子引起脾臟損傷。MKK6、AP-1、IPS-1在感染過程中均無上調(diào)表達，而NF-κB在整個感染過程中一直處于上調(diào)表達?？梢娫贒RV感染雛鴨后PKR參與病毒的識別，并激活NF-κB入核啟動轉(zhuǎn)錄相關因子。下游炎癥因子TNF-α表達趨勢與NF-κB一致，IL-6在感染