丹酚酸A、黃連堿對(duì)糖代謝的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本論文以新藥發(fā)現(xiàn)為核心,開(kāi)展了兩方面的研究:一、丹酚酸A等天然產(chǎn)物對(duì)糖代謝的影響；二、匹諾塞林對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。通過(guò)對(duì)本課題的研究,為新型抗糖尿病及血管性藥物的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分黃連堿、丹酚酸A等對(duì)糖尿病的防治作用研究
　　 糖尿病是一組以胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏為基本病理生理改變,以高血糖為主要臨床特征的慢性?xún)?nèi)分泌代謝性疾病。近年來(lái),其發(fā)病率逐年遞增,已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量和預(yù)期壽命的常見(jiàn)病。在糖

2、尿病患者中,90％以上為2型糖尿病。胰島素抵抗參與了2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程。因此,降低血糖和改善胰島素抵抗是防治糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)。
　　 黃連堿是中藥黃連的主要化學(xué)成分之一,是小檗堿的同系物。已有研究證明,小檗堿具有廣譜抗菌活性。目前已經(jīng)證明小檗堿具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂的藥理作用,在臨床上,已與其它治療糖尿病的藥物聯(lián)合應(yīng)用于治療糖尿病。但一直未見(jiàn)黃連堿在調(diào)節(jié)糖代謝方面的藥理研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃連堿調(diào)節(jié)糖代謝方面的作用進(jìn)行了

3、研究,同時(shí)與小檗堿的藥效進(jìn)行了比較。
　　 丹酚酸A是傳統(tǒng)中藥丹參中的水溶性化學(xué)成分之一,已有研究證明,丹酚酸A具有多方面的藥理活性如:抗氧化、血栓形成抑制、心腦血管損傷保護(hù)、抗肝損傷及肝纖維化、抗腫瘤等作用。本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸A能有效降低糖尿病動(dòng)物模型的血糖,改善糖尿病合并腎病、肝纖維化病變及糖尿病大血管并發(fā)癥病變,對(duì)糖尿病胰島素抵抗可能也有改善作用。本實(shí)驗(yàn)探討了丹酚酸A對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗的防治作用和作用機(jī)制,并同

4、時(shí)與黃連堿、小檗堿的作用及作用機(jī)制進(jìn)行了比較,為發(fā)現(xiàn)新型的同時(shí)具有降糖、治療糖尿病并發(fā)癥,改善胰島素抵抗的藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 一、黃連堿對(duì)動(dòng)物糖代謝的影響
　　 本課題評(píng)價(jià)了黃連堿對(duì)動(dòng)物糖代謝的影響。本研究采用ICR小鼠評(píng)價(jià)了藥物對(duì)正常動(dòng)物糖代謝的影響(分正常組,黃連堿-10、30、100 mg/kg3個(gè)劑量組及格列本脲-2.5 mg/kg組)。并采用四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型,評(píng)價(jià)了黃連堿對(duì)糖尿病動(dòng)物糖代謝的

5、影響(分模型組,黃連堿5、15、50、150 mg/kg4個(gè)劑量組及二甲雙胍-200mg/kg組)。結(jié)果表明(1)正常ICR小鼠口服給藥3天,黃連堿-10 mg/kg劑量明顯降低小鼠的禁食血糖,隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)(給藥6、10天),黃連堿-10、30 mg/kg劑量表現(xiàn)出顯著效果,高劑量未見(jiàn)明顯作用；對(duì)于非禁食血糖,黃連堿在給藥第10天,低劑量才表現(xiàn)出顯著降糖效果,且低劑量降糖效果強(qiáng)于中、高劑量。(2)四氧嘧啶糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃

6、連堿可降低小鼠的禁食血糖和非禁食血糖,改善糖耐量,減少小鼠24 h進(jìn)水/進(jìn)食量,以黃連堿-50 mg/kg作用效果最好。綜合兩種動(dòng)物模型的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,黃連堿具有明確的降糖作用,但降糖作用弱于格列本脲-2.5 mg/kg和二甲雙胍-200 mg/kg。
　　 二、黃連堿對(duì)細(xì)胞糖代謝的影響及機(jī)制研究
　　 在明確黃連堿體內(nèi)降糖作用后,本實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞和大鼠骨骼肌成肌L6細(xì)胞為研究對(duì)象,以小檗堿作為對(duì)照,

7、評(píng)價(jià)了黃連堿對(duì)細(xì)胞糖代謝和線(xiàn)粒體功能的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)黃連堿作用于L6細(xì)胞30 min,10-9～10-5 M各濃度均可明顯促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖攝取:(2)黃連堿10-5、10-4 M與HepG細(xì)胞、L6細(xì)胞共孵育12 h,細(xì)胞對(duì)葡萄糖的代謝量可明顯增加,其作用隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),黃連堿10-6M以下濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)也表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖消耗作用。在10-5、10-4M濃度下,黃連堿對(duì)細(xì)胞糖代謝的促進(jìn)率比insu

8、lin(3×10-8 M)高,但略低于小檗堿(10-5M)；(3)藥物與HepG2細(xì)胞孵育,從10 min～24 h不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。結(jié)果顯示黃連堿10-4M在1-24 h中均可可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞ATP生成,而黃連堿10-9～10-5M則在孵育至24 h時(shí)表現(xiàn)出明顯作用；小檗堿對(duì)細(xì)胞ATP生成無(wú)明顯影響;二甲雙胍與細(xì)胞孵育24 h可明顯提高細(xì)胞內(nèi)ATP含量;與L6細(xì)胞孵育,黃連堿10-4 M在6 h時(shí)可提高ATP含

9、量,其它濃度均未見(jiàn)明顯作用,小檗堿與L6細(xì)胞作用1～6h均可明顯抑制ATP生成,二甲雙胍無(wú)明顯作用。(4)與HepG2細(xì)胞孵育30 min,小檗堿和黃連堿均降低線(xiàn)粒體膜電位；(5)與肝臟/骨骼肌線(xiàn)粒體孵育10 min,黃連堿10-5M可降低肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈Ⅰ的V3、V4、RCR、OPR,升高ADP/O,同時(shí)降低骨骼肌線(xiàn)粒體呼吸鏈Ⅰ的V3、RCR、OPR;黃連堿對(duì)肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈Ⅱ呼吸功能影響不顯著;(6)與肝臟線(xiàn)粒體孵育10 min,黃

10、連堿10-5、10-4 M可促進(jìn)F0F1-ATPase活性；(7)與肝臟線(xiàn)粒體孵育10 min,在底物刺激下黃連堿可促進(jìn)線(xiàn)粒體ATP生成,提高ATP含量。
　　 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,黃連堿能促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、利用,其體外實(shí)驗(yàn)有效濃度在10-6～10-4 M之間,作用強(qiáng)度略低于小檗堿。作用機(jī)制研究顯示,黃連堿可能通過(guò)抑制線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ的功能,降低線(xiàn)粒體膜電位,而發(fā)揮降糖作用,與小檗堿的降糖作用機(jī)制類(lèi)似。但是,黃連堿可通過(guò)促進(jìn)

11、線(xiàn)粒體氧化磷酸化效率,促進(jìn)ATP生成,進(jìn)而促進(jìn)糖代謝,這是不同于小檗堿的作用機(jī)制。
　　 三、丹酚酸A、黃連堿等改善胰島素抵抗的作用
　　 本研究以自發(fā)性2型糖尿病胰島素抵抗KKay小鼠模型為研究對(duì)象,連續(xù)給予丹酚酸A(分0.3、1.0、3 mg/kg)、黃連堿-100 mg/kg和小檗堿-100 mg/kg9周,評(píng)價(jià)這些化合物對(duì)小鼠糖尿病模型胰島素抵抗改善的作用,同時(shí)在細(xì)胞水平評(píng)價(jià)了藥物對(duì)胰島素協(xié)同的作用。
　　

12、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)KKay小鼠經(jīng)過(guò)自然病程16周,出現(xiàn)胰島素抵抗；(2)丹酚酸A、黃連堿、小檗堿口服給藥均可改善口服葡萄糖耐量,丹酚酸A藥效強(qiáng)于后兩者；(3)丹酚酸A、黃連堿、小檗堿均改善胰島素耐量,丹酚酸A效果優(yōu)于后兩者；(4)丹酚酸A、黃連堿、小檗堿均降低小鼠禁食血糖、餐后血糖、果糖胺和HbAlc,丹酚酸A效果好于后兩者；(5)丹酚酸A降低小鼠血漿中TG和LDL,對(duì)HDL和CHO無(wú)明顯影響:黃連堿、小檗堿對(duì)小鼠血脂無(wú)明顯影響。

13、(6)丹酚酸A、黃連堿、小檗堿均降低小鼠24 h進(jìn)食/進(jìn)水量,丹酚酸A作用強(qiáng)于后兩者；(7)丹酚酸A、黃連堿、小檗堿均可降低糖尿病小鼠體重。(8)丹酚酸A、黃連堿、小檗堿在HepG2細(xì)胞/L6細(xì)胞上與胰島素有協(xié)同作用,丹酚酸A的效果弱于后兩者。本研究結(jié)果顯示,丹酚酸A可較好地改善KKay小鼠的胰島素抵抗,黃連堿、小檗堿也有改善小鼠胰島素抵抗的作用,但是效果低于丹酚酸A;在細(xì)胞水平上,黃連堿、小檗堿的作用效果強(qiáng)于丹酚酸A。
　　

14、四、丹酚酸A、黃連堿等改善胰島素抵抗的機(jī)制
　　 本部分進(jìn)一步研究了丹酚酸A、黃連堿、小檗堿改善胰島素抵抗的作用機(jī)制,并進(jìn)行了藥物之間作用機(jī)制的對(duì)比。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)丹酚酸A通過(guò)多種機(jī)制改善胰島素抵抗,增加胰島素敏感性。分別為①調(diào)控線(xiàn)粒體功能,表現(xiàn)為促進(jìn)線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ、F0F1-ATPase、琥珀酸脫氫酶的活性,促進(jìn)胰島素抵抗L6細(xì)胞ATP的生成；②改善氧化應(yīng)激狀態(tài),降低胰島素抵抗L6細(xì)胞ROS的生成；③促進(jìn)

15、PI3K磷酸化,增加GLU4表達(dá)及轉(zhuǎn)位,促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、利用;④調(diào)控AMPK-PGC-1α-Sirt3軸,促進(jìn)線(xiàn)粒體生物合成,調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝;(2)黃連堿可促進(jìn)線(xiàn)粒體F0F1-ATPase酶活性,促進(jìn)胰島素抵抗L6細(xì)胞ATP的生成,降低胰島素抵抗L6細(xì)胞ROS的生成；激活A(yù)MPK,調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝(3)小檗堿可激活A(yù)MPK,調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,丹酚酸A、黃連堿、小檗堿改善IR的作用機(jī)制有共同的方面,也有不同之處。
　

16、　 第二部分匹諾塞林對(duì)腦線(xiàn)粒體呼吸功能的促進(jìn)作用
　　 匹諾塞林是一種廣泛存在于蜂膠和植物中的黃酮類(lèi)天然化合物,具有抗菌、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用,本部分對(duì)其腦缺血保護(hù)作用的機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用大鼠全腦缺血模型(4-vessel occlusion,4-VO),評(píng)價(jià)了匹諾塞林在體內(nèi)對(duì)4-VO大鼠腦線(xiàn)粒體功能的保護(hù)作用。結(jié)果表明:(1)匹諾塞林降低4-VO全腦缺血大鼠的神經(jīng)學(xué)評(píng)分及神經(jīng)病理分級(jí),

17、減輕神經(jīng)元損傷；(2)匹諾塞林可明顯提高4-VO大鼠腦線(xiàn)粒體的ADP/O比值、V3以及RCI、OPR等參數(shù),保護(hù)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整性;(3)體外實(shí)驗(yàn)表明,匹諾塞林能顯著提高分離的腦線(xiàn)粒體的ADP/O、V3、RCI、OPR,降低V4,保護(hù)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整性；(4)匹諾塞林在體外可促進(jìn)腦線(xiàn)粒體ATP的生成,可促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞的ATP生成。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)匹諾塞林對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過(guò)保護(hù)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)與功能的完整性,降

18、低NADH呼吸鏈的電子漏流,提高氧化磷酸化效率,促進(jìn)線(xiàn)粒體呼吸功能,提升線(xiàn)粒體ATP合成能力等實(shí)現(xiàn)的。
　　 綜上所述,黃連堿有降低正常小鼠及四氧嘧啶小鼠血糖的作用,可在細(xì)胞水平上促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)利用,但是效果弱于小檗堿。在改善胰島素抵抗方面,丹酚酸A改善體內(nèi)胰島素抵抗的效果強(qiáng)于黃連堿、小檗堿,但是在細(xì)胞水平上,黃連堿、小檗堿的效果卻優(yōu)于丹酚酸A,三者改善胰島素抵抗的機(jī)制相似,但不完全相同。本研究還發(fā)現(xiàn)匹諾塞林可通過(guò)保護(hù)線(xiàn)粒體