丹酚酸抗氧化活性標識及對組織損傷保護作用.pdf

1、丹酚酸是一大類植物多酚化學物，在唇形科鼠尾草屬(Salvia L.)植物中含量豐富。研究表明，丹酚酸在活血化瘀、增加冠脈血流量、抗動脈粥樣硬化等方面有顯著生物活性，對缺血和缺血再灌注引起的損傷有保護作用，丹酚酸的生物活性及功效已越來越受到人們的重視。但是，由于丹酚酸類物質種類多、結構相似而繁雜、數量消長缺乏規(guī)律性等原因，給這類物質的高通量活性篩選及作用機制研究帶來了很大困難。 氧化性損傷是導致所有血管相關性疾病共同的作用機制。基

2、于對丹酚酸多羥基結構的分析，我們推測抗氧化活性可能是其具有多種生理作用的主要機制之一。本課題以丹酚酸為代表，對丹酚酸成分進行分離及表征，探討丹酚酸的體內、體外的抗氧化能力，并利用高效液相色譜(HPLC)構建了植物多酚抗氧化活性高通量標識技術，對丹酚酸保護組織氧化性損傷的作用途徑進行了初步探討。為多酚類植物化學物高通量活性篩選研究提供了一種嶄新的技術方法，為進一步研究丹酚酸對血管相關性疾病的作用機制奠定基礎。 目的：探討丹酚酸抗氧

3、化活性作用機制及其與組織氧化損傷保護之間的關系，構建植物多酚在線抗氧化活性高通量篩選技術，為研究丹酚酸對血管相關性疾病的作用機制奠定基礎，并開拓植物化學物分析新方法。 方法：選用丹酚酸含量豐富的鼠尾草屬植物丹參為原料，采用溶劑萃取、大孔吸附樹脂純化等技術分離以獲得不同種類和含量的丹酚酸，并以標準對照和高效液相色譜(HPLC)進行表征。采用清除二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)自由基、還原能力、亞鐵離子的螯合能力、對β-胡蘿卜素的漂

4、白能力以及鄰啡羅啉(Plaen)-Cu-AscA-H<,2>O<,2>-DNA體外化學發(fā)光體系5種體外抗氧化反應模型綜合評價丹酚酸的抗氧化能力和對DNA氧化損傷的保護作用。在此基礎上建立大鼠急性肝損傷模型，研究丹酚酸在體內對氧化損傷組織的保護作用。以HPLC為手段，通過引入DPPH有機自由基與丹酚酸發(fā)生在線清除反應，發(fā)展抗氧化活性標識技術；HPLC定量測定丹酚酸作為血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)的活性，研究活性氧(RDS)產生與丹酚

5、酸生物活性的關系。 結果： 1．從鼠尾草植物丹參的根部獲得3種不同組成和純度的丹酚酸AE、EE和RE，得率分別為73.2％、3.6％、2.2％。各丹酚酸在4℃干燥條件下保存，性狀穩(wěn)定，粉末性良好。在本實驗條件下，3種丹酚酸HPLC色譜圖中呈現8個共有峰，其中3個為標準對照丹參素(DSS)、咖啡酸(CA)、丹酚酸B(Sal B)所確認，Sal B含量分別為5.60％、74.38％和90.45％。丹酚酸水溶液在80℃和90℃

6、下加熱120min后，和在60℃相同時間下的加熱相比， Sal B的含量有較大幅度的下降(p<0.05)，但在pH3條件下的熱處理組Sal B含量沒有顯著變化。 2.在本實驗采用的5種模型中，丹酚酸均表現出不同程度的抗氧化能力。丹酚酸AE、EE和RE在濃度為100μg/mL時對DPPH自由基的清除活性(％)分別為35.87±0.34、88.55±0.12、89.48±0.12；還原能力(以吸光度表示)分別為0.106±0.00

7、15、0.7624.±0.0053、0.8016±0.0076；對亞鐵離子鰲合能力(％)分別為2.08±0.05、1.28±0.22、0.39±0.03；對β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液的漂白能力(％)分別為2.63±0.09、8.73±1.74、14.47±2.19;AE、EE、RE對DNA氧化損傷的保護能力的IC50分別為1293.6、62.0、49.2μh/mL。其中，對DPPH自由基清除能力、還原能力、對β-胡蘿卜素的漂白能力以及對

8、羥自由基損傷DNA的保護作用均與濃度在一定范圍內呈量效關系。相關性分析顯示丹酚酸中Sal B含量和還原能力的相關性最高，相關系數(r)為0.9644，其次為對DNA氧化損傷的保護作用，r為0.9012。 3.丹酚酸對大鼠急性肝損傷模型的保護作用結果顯示，與CCl<,4>組相比，丹酚酸RE能明顯降低大鼠血清AST、ALT的含量(p<0.05)，各丹酚酸RE組大鼠血清和肝組織的SOD活性活力上升，MDA含量降低，GSH含量升高(p<

9、0.05)，能減輕肝組織的病理改變。 4.本實驗以丹酚酸為例，構建了植物化學物在線清除自由基活性指紋標識技術，該技術能夠在不需分離制備情況下，實現快速檢測、篩選抗氧化植物化學物先導成分。結果一次性獲得13種丹酚酸清除DPPH自由基活性，隨著丹酚酸濃度的增高，各丹酚酸對DPPH自由基的清除能力逐漸增大。其中出峰時間在55.8min的sal B清除自由基的能力最高，其后依次為SA8>SA6>SA12>SA5>SA1。 5.采

10、用HPLC定量測定丹酚酸的血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)活性結果顯示：建立的色譜條件下，可通過測定血管緊張素轉換酶(ACE)水解馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu)后產生的馬尿酸的量獲得丹酚酸的ACEI活性。香丹注射液(以丹酚酸為主成分)和丹酚酸EE對ACE有明顯的抑制作用，香丹注射液濃度為原注射液的1/8時，抑制活性達到39.95％，丹酚酸EE濃度在1mg/nL時，抑制活性為31.44％，隨著各自濃度的上升，其ACEI

11、活性逐漸增加，有一定的量效關系。DSS、CA、原兒茶醛、Sal B在濃度為1mg/mL，時， ACEI活性分別為94.70％、62.26％、49.39％、23.14％。 結論：建立的HPLC條件，能對丹酚酸的不同組分進行標識和表征。在采用的反應體系中，丹酚酸表現出不同程度的抗氧化能力，對DNA損傷具有保護作用。Sal B可能是丹酚酸中的主要抗氧化物質。丹酚酸抗氧化途徑主要是通過酚羥基提供氫質子，破壞自由基鏈式反應過程。通過抑制D

12、NA鏈的斷裂并延遲其受損時間，從而消除羥自由基對DNA的攻擊損傷。體內氧化損傷模型研究表明，丹酚酸可提高實驗性大鼠機體抗氧化能力，減輕CCl<,4>對機體造成的急性肝損傷，丹酚酸對氧化損傷的肝組織具有一定保護作用。 通過HPLC-DPPH在線標識技術，能夠實現對多組分丹酚酸抗氧化能力的同時綜合研究。不同丹酚酸物質對DPPH自由基清除的活性各不相同，Sal B是丹酚酸中活性最高的物質。丹酚酸ACEI活性研究及特征標識結果提示，丹酚