基于比較基因組學(xué)和mRNA高通量測(cè)序的可變剪接外顯子進(jìn)化研究.pdf

1、可變剪接作為真核生物基因組中普遍存在的基因調(diào)控機(jī)制，與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育以及多種疾病的發(fā)生都有著密切關(guān)系。在漫長(zhǎng)的物種演化過(guò)程中，可變剪接以外顯子為基本單位不斷進(jìn)化，其進(jìn)化結(jié)果表現(xiàn)為可變剪接外顯子在不同物種中剪接方式、調(diào)控元件、表達(dá)量、對(duì)應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)功能等方面的差異?？勺兗艚油怙@子的出現(xiàn)與進(jìn)化不但提高了基因組的使用效率，也成為生物體獲得新基因功能的重要途徑。因此，研究可變剪接外顯子的進(jìn)化及其對(duì)基因調(diào)控、基因調(diào)控以及物種進(jìn)化的影響就成為了分子

2、遺傳學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)中一個(gè)有趣的研究方向。
　　 近年來(lái)，隨著基因組計(jì)劃的大規(guī)模開(kāi)展、比較基因組學(xué)研究方法的日趨成熟以及高通量測(cè)序技術(shù)在科研中的廣泛應(yīng)用，使得利用比較基因組學(xué)和高通量測(cè)序大規(guī)模的開(kāi)展可變剪接外顯子進(jìn)化研究成為可能。本文中，我們通過(guò)多種比較基因組學(xué)方法和人類(lèi)、大鼠、小鼠多物種Solexa高通量測(cè)序、熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)手段在不同水平上對(duì)可變剪接外顯子的進(jìn)化規(guī)律和生物學(xué)意義進(jìn)行了研究。
　　 首先，我們通過(guò)約1

3、00個(gè)自編perl程序腳本(12個(gè)核心程序詳見(jiàn)第二章方法部分)及多種生物信息學(xué)軟件首次構(gòu)建了可變剪接外顯子進(jìn)化分析系統(tǒng)(Alternative Splicing Exon Evolution Analyzer，ASEEA)，ASEEA涵蓋了Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中2萬(wàn)多條人類(lèi)基因、20多萬(wàn)個(gè)外顯子，系統(tǒng)整合了外顯子進(jìn)化選擇壓、蛋白結(jié)構(gòu)域、剪接調(diào)控元件、重復(fù)序列以及基于多物種Solexa測(cè)序的外顯子表達(dá)量等進(jìn)化相關(guān)信息，為系統(tǒng)性研究可變剪接

4、外顯子進(jìn)化規(guī)律提供了有力的分析工具。同時(shí)ASEEA也是首次使用高通量測(cè)序研究可變翦接外顯子的相對(duì)表達(dá)量，其中部分程序?qū)ζ渌诟咄繙y(cè)序的可變剪接研究也有一定參考價(jià)值。
　　 利用ASEEA，我們首次結(jié)合比較基因組學(xué)與mRNA高通量測(cè)序系統(tǒng)性總結(jié)了可變剪接外顯子的進(jìn)化規(guī)律。分析結(jié)果顯示，可變剪接外顯子的保守性低于組成型外顯子，在可變剪接外顯子中，古老外顯子的進(jìn)化選擇壓較大、表達(dá)量較高、重復(fù)序列包含率較低、與蛋白結(jié)構(gòu)域重合的比例也

5、較高，而年輕外顯子則正好相反。該趨勢(shì)體現(xiàn)了外顯子進(jìn)化中‘序列-表達(dá)-功能’的一致性，反映了可變剪接外顯子從被引入轉(zhuǎn)錄本(exon recruiting)到獲得功能(gain-of-function)進(jìn)而固定在轉(zhuǎn)錄本中(fixation)的過(guò)程，而在此過(guò)程中重復(fù)序列的插入和正選擇事件可能發(fā)揮了重要作用。我們還發(fā)現(xiàn)，可變剪接外顯子對(duì)基因功能獲得的貢獻(xiàn)度在進(jìn)化中不斷上升。通過(guò)對(duì)比不同物種的Solexa數(shù)據(jù)我們觀察到直系同源外顯子表達(dá)量上存在明

6、顯的種問(wèn)差異，提示可變剪接對(duì)高等生物的表型差異有重要貢獻(xiàn)，而可變剪接外顯子在物種進(jìn)化中也存在相對(duì)表達(dá)量提高的趨勢(shì)。此外，我們還首次對(duì)非盒式可變剪接外顯子(特別是內(nèi)含子保留型可變剪接，intron retention)的部分進(jìn)化規(guī)律進(jìn)行了分析。
　　 其次，我們利用ASEEA對(duì)Memorial Sloan-Kettering Cancer Center腫瘤相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的2006條腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行了可變剪接外顯子進(jìn)化研究。結(jié)果顯

7、示腫瘤相關(guān)基因中可變剪接外顯子的進(jìn)化符合可變剪接外顯子進(jìn)化的一般規(guī)律。同時(shí)，我們首次報(bào)道了腫瘤相關(guān)基因外顯子在外顯子年齡、進(jìn)化選擇壓、蛋白結(jié)構(gòu)域、剪接調(diào)控元件和表達(dá)量等方面的進(jìn)化保守性?xún)A向，說(shuō)明腫瘤相關(guān)基因受到更嚴(yán)格的剪接調(diào)控，在引入新外顯子時(shí)更具選擇性。此外，我們還構(gòu)建了基于MySQL的腫瘤相關(guān)基因可變剪接外顯子進(jìn)化數(shù)據(jù)庫(kù)(OncoAS)，并通過(guò)綜合數(shù)據(jù)檢索篩選出了部分可能發(fā)生重要進(jìn)化事件的可變剪接外顯子。
　　 最后，根據(jù)O

8、ncoAS數(shù)據(jù)庫(kù)的提示，我們選取了VEGFA和PPAR-gamma進(jìn)行進(jìn)一步研究。在VEGFA的研究中，我們?cè)谛∈?、家兔中首次?bào)道了包含可變剪接外顯子exon8b的抑制血管生成型VEGFA轉(zhuǎn)錄本，定量分析顯示該轉(zhuǎn)錄本相對(duì)表達(dá)量在進(jìn)化中持續(xù)上升，exon8b經(jīng)歷了從低等哺乳動(dòng)物中低相對(duì)表達(dá)量外顯子(minor form exon)到人類(lèi)中高相對(duì)表達(dá)量外顯子(major form exon)的轉(zhuǎn)變并伴有剪接調(diào)控元件的強(qiáng)化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們提

9、出了VEGF基因調(diào)控機(jī)制形成的假說(shuō)，提示exon8b與另一可變剪接外顯子exon6的引入都是基因調(diào)控機(jī)制形成的重要步驟，對(duì)蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞定位與生理功能的發(fā)揮具有重要意義。在PPAR-gamma的研究中，我們發(fā)現(xiàn)該基因中的四個(gè)可變剪接外顯子處在從外顯子招募到獲得功能的不同進(jìn)化階段，其中exonB作為唯一一個(gè)編碼的可變剪接外顯子仍處在快速進(jìn)化中，其在嚙齒類(lèi)中可能發(fā)生了正選擇事件并獲得了與脂肪貯存相關(guān)的功能。這些發(fā)現(xiàn)不僅在個(gè)體基因水平上進(jìn)一步