Aβ寡聚體單克隆抗體的制備及功能研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種常見的漸進性神經退行性疾病。其典型的病理特征為大腦皮層及海馬區(qū)的β淀粉樣肽（Amyloid β-peptide，Aβ）在胞外積累并形成老年斑（senile plaque，SP）、腦神經細胞內tau蛋白異常聚集形成的神經原纖維纏結（neurofibrillary tangle，NFT）以及神經元突觸功能異常及錐體神經細胞丟失。目前認為Aβ是導致神經元損傷及認知功能障礙的主要

2、致病物質。研究表明，針對Aβ的主動免疫和被動免疫療法可以減少轉基因AD模型小鼠腦內聚集的Aβ纖維，并且能夠明顯改善模型小鼠的認知能力。 本課題主要進行了Aβ1-42寡聚體單克隆抗體（McAb，以下簡稱單抗）的制備、鑒定以及其體內、外功能研究?！　∫弧β寡聚體單抗的制備及性質鑒定。 在體外將化學合成的Aβ1-42聚合成Aβ寡聚體，用Aβ寡聚體免疫小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，通過有限稀釋法克隆和間接E

3、LISA篩選，獲得穩(wěn)定分泌Aβ寡聚體單抗的雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞注入小鼠腹腔誘生腹水，采用A蛋白親和層析從腹水中純化制備Aβ單抗。并通過SDS-PAGE檢測純化后抗體的純度，Western Blot檢測單抗對Aβ寡聚體的識別，競爭ELISA測定單抗的抗原識別表位與親和常數。結果顯示：獲得一株穩(wěn)定分泌Aβ寡聚體單抗的雜交瘤細胞株（A8），純化后單抗A8的純度達到95％以上。A8對16．5-25 KD的Aβ寡聚體有較高的親和力，為IgG

4、3亞類，抗原識別表位位于Aβ分子N端的1-6位氨基酸，親和常數為7．89×10-8?！　?二、A8單抗的體外及體內生物學活性研究。 為了解單抗A8對Aβ寡聚體誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用，以Aβ寡聚體誘導SH-SY5Y細胞損傷，用CCK8檢測細胞活性。結果顯示：1μmol/L單抗A8可顯著降低20 μmol/L Aβ寡聚體對細胞的毒性作用（p<0．05）。所以單抗A8可以在體外抑制Aβ寡聚體對SH-SY5Y細胞的

5、毒性。 隨后利用SAMP8模型小鼠，對單抗A8的治療作用進行了探討，取8周齡SAMP8小鼠腹腔注射A8（500 μg/只），治療結束后進行Morris水迷宮行為學實驗，之后處死小鼠取腦，做石蠟切片免疫組化分析，并對鼠腦全蛋白做Western Blot檢測。結果顯示，治療組小鼠行為學有一定改善，大腦中的Aβ水平及磷酸化tau蛋白降低（p<0．05），tau蛋白沒有變化。 三、A8單抗輕鏈重鏈可變區(qū)基因的克隆與分析。

6、 人源化改造是鼠源單抗用于人體的重要基礎，為此采用5'RACE法擴增與克隆了A8單抗的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因，并克隆入pMD18-T載體中。測序結果顯示重鏈可變區(qū)基因序列全長450 bp，編碼150個氨基酸；輕鏈可變區(qū)基因序列全長429 bp，編碼143個氨基酸。在GeneBank對氨基酸序列進行比對分析，二者均符合小鼠IgG可變區(qū)基因的特征。 總之，本研究成功制備并獲得了Aβ寡聚體單抗A8，該抗體對Aβ寡聚體有較高的親和力，為I