肝特異表達的F蛋白的克隆及其在臨床檢驗上應用的研究.pdf

1、目的：肝病是影響人們健康的最重要的疾病之一，而肝癌又被稱為“癌中之王”。在我國僅乙肝病毒攜帶者就有一億多人，而其他病毒性肝炎、各種慢性肝病、肝硬化、中毒性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病以及肝臟腫瘤等人數(shù)眾多。因此，肝病的實驗診斷就構(gòu)成了醫(yī)學實驗診斷學的重要組成部分。然而，長期以來，臨床上對肝細胞損傷的診斷更多地依賴于各種相關(guān)的酶學檢查，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等。盡管這些酶類能夠在一定的程度上反映肝臟的損害，但是酶學的

2、檢測具有一定的局限性。首先，有些酶類并不是單一地反映肝臟組織疾病的進程，其他器官組織的疾病也可能出現(xiàn)肝臟相關(guān)酶類的變化；同時，許多反映肝臟相關(guān)疾病的酶類可以被諸多因素如藥物、毒物等所誘導，難以反映肝臟疾病的真正變化趨勢和程度。所以，長期以來，人們希望能夠找到特異地反映肝臟細胞實質(zhì)性損傷的診斷指標來準確地指導臨床的治療和判斷預后。盡管肝臟的組織活檢能夠較真實地反映肝臟的損傷情況，但這一手段畢竟是一種有創(chuàng)的檢查，難以被患者所接受。因此，找到

3、一種即靈敏又特異地反映肝細胞損傷的簡便的實驗方法就成為我們的研究方向。 人肝臟F蛋白是一種組織特異性抗原(tissue Specific antigen，TSA)，它嚴格定位于肝臟細胞，其生物學功能尚不清楚。作為TSA的一種F蛋白在自身免疫性肝病與肝移植中的作用正逐漸被人們所認識。尤其重要的是，近年來F蛋白的基礎(chǔ)研究表明，存在于肝臟組織細胞中的F蛋白濃度與血清F蛋白的濃度之間存在著巨大差異，同時其具有嚴格的組織特異性。F蛋白的這

4、種特性奠定了它成為一種反映肝細胞損傷程度的靈敏和特異的指標的基礎(chǔ)。 從80年代開始，人們研究血清F蛋白含量與肝臟疾病如急、慢性肝炎、肝癌和肝中毒所致肝損傷程度的關(guān)系，獲得了一些臨床數(shù)據(jù)。然而，F(xiàn)蛋白在臨床檢驗上的應用遇到了障礙。主要的原因是F蛋白的來源難以保證，盡管有一些學者報道采用提純的方法得到了F蛋白，但由于實驗材料的獲得比較困難、采用的分離提純方法的不一致以及標準的不統(tǒng)一等等，導致學者們的結(jié)果難以相互驗證，因此目前尚沒有商

5、品的F蛋白及其診斷試劑應用于臨床。 為了使這一能夠直接反映肝細胞損傷程度的生物學標志蛋白早日在肝病的實驗診斷中發(fā)揮作用，滿足臨床的需要，本文試圖采用分離提純和基因工程的方法得到F蛋白，使這兩種方法獲得的F蛋白相互驗證建立標準解決上述問題。因此，本文做了如下工作：人和大鼠肝臟特異F蛋白的克隆與表達、人肝臟組織F蛋白的提純、 F蛋白診斷試劑的研制及其在臨床檢驗上應用的初步探討以及與肝臟腫瘤相關(guān)的C53蛋白在肝癌、膽管癌和肝纖維化組織

6、中的表達等研究。 方法：論文第一部分，分別提取大鼠和人肝臟總RNA，確定其純度和完整性后對其進行反轉(zhuǎn)錄和PCR(RT-PCR)擴增出目的基因(F—protein’s cDNA)，進行瓊脂糖電泳檢測目的基因，然后將大鼠和人的目的基因分別與pUCm—T載體進行連接獲得克隆質(zhì)粒pUCm-T-F并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中；將結(jié)果正確的克隆片斷與表達載體：pET-15b連接，獲得F蛋白的表達質(zhì)粒pET15b—F并將其轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21

7、(DE3)pLysS中，用1mM IPTG誘導表達大鼠和人的目的蛋白，表達后的全菌蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，用Ni<'2+>-charged IDA His—bind coluiiln對目的蛋白進行純化，并最終用Western—blot進行鑒定。論文 第二部分，將取白手術(shù)來源的人肝臟組織，經(jīng)低溫勻漿、飽和硫酸氨沉淀粗提后再經(jīng)DEAE—Cellulose 52、Sephacryl S-200和CM—Cellulose-23

8、柱層析，最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。在人肝臟F蛋白提純的過程中，每一步均經(jīng)用BALB/c小鼠肝勻漿免疫C3H小鼠的抗F蛋白抗血清，進行F蛋白提純過程的鑒定，分離過程中所選取的沉淀、層析各部分與小鼠抗F蛋白抗血清均出現(xiàn)抗原抗體反應的沉淀帶。純度鑒定采用SDS--聚丙烯酰胺凝膠電泳。 論文第三部分，用Ni<'2+>—charged IDA HiSIbind column純化的人肝臟F蛋白作為抗原免疫兔得到F蛋白的多克隆抗體；用間接

9、ELISA法及Westem blot法分別對制備的多克隆抗體的效價和特異性進行測定；對用此多克隆抗體作為ELISA診斷試劑的指標進行分析；用此試劑檢測收集的90例肝病患者(其中肝硬化39例、肝細胞癌15例、急性乙型肝炎21例、慢性乙型肝炎15例)、28例其他非肝臟疾病患者(心絞痛、糖尿病、腦梗塞、高血壓)和32例新生兒血清與50例對照血清標本。 論文第四部分，選取來自天津市第三中心醫(yī)院2005年4月至2007年2月期間住院并有明

10、確臨床診斷的肝臟腫瘤和肝纖維化患者組織標本，其中高分化肝細胞癌及癌旁組織各5例，中低分化肝細胞癌及癌旁組織各5例，肝內(nèi)膽管癌及癌旁組織各5例，早期輕微肝臟纖維化5例。用近期文獻特征的一個新的C53蛋白的抗體，采用常規(guī)修復方法進行免疫組化染色和鏡檢分析，探討C53蛋白在各種類型肝臟腫瘤組織中表達的差異。 結(jié)果：第一部分，克隆與表達了大鼠F蛋白，表達后的全菌蛋白的SDS.PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，目的帶分子量約為43kD，與預期值相

11、符；其表達量約為全菌總蛋白量的40％；表達的F蛋白與豚鼠抗人F蛋白多克隆抗血清呈陽性反應。人肝臟F蛋白的克隆與表達結(jié)果顯示，目的基因為1134bp，與Gene-bank所提供的大鼠F蛋白基因編碼序列大小相近。誘導表達后的全菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，其目的蛋白的大小約為43kD；Western-blot結(jié)果顯示，表達的人肝臟特異F蛋白與豚鼠抗人F蛋白多克隆抗體發(fā)生了較強的免疫反應，提示，經(jīng)基因工程方法得到的人F蛋白具有免疫

12、活性，可用于后續(xù)的臨床檢驗實驗研究。 第二部分，人肝臟組織勻漿含總蛋白50427 mg，經(jīng)離心和硫酸氨沉淀后獲得了5468rag的粗制F蛋白，經(jīng)DEAE-Cellulose 52、Sephacryl S-200、CM-Cellulose-23柱層析后分別獲得1690、610和48mg F蛋白富集的蛋白組分。在人肝臟F蛋白提純的過程中，對所得到的各蛋白組分分別用BALB/c小鼠肝勻漿免疫C3H小鼠的抗F蛋白抗血清進行鑒定的結(jié)果顯示

13、，均出現(xiàn)陽性免疫反應沉淀帶。分離純化后的F蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到了分子量為43 KD的優(yōu)勢條帶，與文獻報道的F蛋白分子量一致。 第三部分，用人肝組織來源克隆表達的F蛋白免疫兔所得的抗血清免疫效價可達1：25600，抗血清用于F蛋白檢測試劑的靈敏度和免疫交叉反應的實驗結(jié)果顯示，其檢測靈敏度達到0.5ug/孔(10 ug/m1)；批內(nèi)重復性CV值在5.5％、批間重復性CV值在10％左右；F蛋白檢測與HbsAg、HbeAg、H

14、AV、HCV、HDV、HEV、HSⅥ、HSⅦ等抗原和大腸桿菌無免疫交叉反應；抗原和抗體反應時間1小時為最佳反應時間；該試劑在4。C，保存6個月后P/N比值下降15％左右，而且陽性血液標本稀釋100倍其P/N比值仍在線性范圍內(nèi)。采用雙夾心法分析人血清標本結(jié)果顯示，39例肝硬化患者中有19例呈陽性反應，占48％；15例肝腫瘤患者中100％呈陽性反應；21例急性乙肝患者中90％呈陽性反應；15例慢性肝炎患者中30％呈陽性反應；非肝臟疾病患者(

15、心絞痛、糖尿病、腦梗塞、高血壓)共28例只有一例出現(xiàn)陽性結(jié)果；32例新生兒血清F蛋白結(jié)果均為陰性；50例正常對照血清標本中，有3例呈弱陽性反應，其余均為陰性，各組結(jié)果與正常對照比較具有統(tǒng)計學差異。第四部分，對肝腫瘤組織和肝纖維化組織切片進行免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)C53蛋白在肝癌組織中有較強表達(++以上)，在癌旁組織中有弱表達(+-)，在早期輕微肝纖維化組織中沒有表達(-)。初步表明C53蛋白與肝臟腫瘤相關(guān)。 結(jié)論：用基因工程技術(shù)首次

16、從人肝組織中克隆與表達了肝特異性F蛋白，在Gene-bank上發(fā)布了序列號為DQl88836的人肝F蛋白的cDNA序列。在此基礎(chǔ)上從大鼠和人的肝臟克隆表達得到的F蛋白和從人的肝臟中提純獲得的F蛋白的分子量與文獻報道一致。提示在不同種屬動物中F蛋白功能的相似性。 克隆表達的大鼠F蛋白、人F蛋白與人肝臟組織純化的F蛋白免疫豚鼠所獲得的抗人F蛋白多克隆抗體均具有較強的免疫反應，表明所克隆的大鼠和人的F蛋白均具有人肝臟F蛋白的免疫活性。

17、 本文所選用的分離提純方法是在綜合了前人的工作經(jīng)驗基礎(chǔ)上確定的，尤其是小鼠抗F蛋白抗血清在分離過程中的使用使得整個提純過程更加嚴謹。提純的F蛋白與克隆得到的F蛋白的相互驗證使F蛋白的系統(tǒng)研究工作更加完善，也進一步證明了F蛋白的肝臟特異性。 采用克隆人肝臟特異F蛋白免疫兔所得到用于臨床使用的多克隆F蛋白抗血清作為診斷試劑，其靈敏度和特異性能夠初步滿足臨床分析各種肝病患者標本的需要。分析結(jié)果顯示，F(xiàn)蛋白這一指標對肝病的診斷具