急性髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤患者骨髓間充質(zhì)干細胞成脂肪成骨分化能力與粘附分子表達水平比較.pdf

1、急性髓系細胞性白血病是造血干細胞異常的惡性疾病。與正常造血干細胞平衡的增殖分化過程相比，急性髓系白血病造血干細胞因持續(xù)增殖而失去進一步分化成各類血細胞的能力。近年來在急性髓系白血病的發(fā)病機理研究中，越來越多的證據(jù)表明除了控制造血干細胞增殖分化凋亡通路的基因（主要包括信號傳遞分子和轉(zhuǎn)錄因子）的突變，微環(huán)境對造血干細胞的增殖分化以及遷移也有重要影響。越來越多的研究者認為造血干細胞需要特定的微環(huán)境來維持其干細胞狀態(tài)，一旦離開該特定微環(huán)境或者特

2、定微環(huán)境發(fā)生改變，造血干細胞則會轉(zhuǎn)向增殖分化的狀態(tài)。造血干細胞的特定微環(huán)境主要由基質(zhì)細胞（可分為間充質(zhì)干細胞，成骨細胞，成脂肪細胞，血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞）和細胞外基質(zhì)組成。
　　微環(huán)境中許多組分都被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控造血干細胞的功能，例如成骨細胞被報道可以控制龕的大小，被認為是造血干細胞微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分。最近骨髓間充質(zhì)干細胞也被發(fā)現(xiàn)是構(gòu)成造血干細胞微環(huán)境的重要成分，該類間充質(zhì)干細胞缺失的小鼠骨髓中造血干細胞數(shù)量減少而且歸巢能力也

3、有損傷。骨髓間充質(zhì)干細胞更可進一步分化為成骨和成脂肪細胞，因此骨髓間充質(zhì)干細胞的分化能力也是影響造血干細胞微環(huán)境的因素。除了增殖分化外，造血干細胞的歸巢能力會影響臨床上干細胞移植的效果，而造血干細胞微環(huán)境中組成細胞的粘附分子被認為與歸巢能力有關(guān)，其中當然也包括間充質(zhì)干細胞和其分化而成的各種細胞。因此間充質(zhì)干細胞與急性髓系白血病可能有相關(guān)性。然而關(guān)于臨床上急性髓系白血病患者的骨髓間充質(zhì)干細胞的特征/分化能力/粘附分子表達情況的報道很少。因

4、此我們分析了急性髓系白血病患者來源的骨髓間充質(zhì)干細胞的特征和成脂肪成骨能力，并用Real-time PCR的方法檢查了相關(guān)基因與粘附蛋白的表達，與非骨髓病變的非霍奇金淋巴瘤患者和正常對照進行比較，為進一步研究間充質(zhì)干細胞在造血干細胞微環(huán)境維持上的功能和急性髓系白血病病理研究提供臨床上的數(shù)據(jù)結(jié)果。
　　第一部分急性髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤患者骨髓間充質(zhì)干細胞特征及成脂肪成骨分化能力比較
　　目的：比較急性髓系白血病患者與非骨

5、髓病變的非霍奇金淋巴瘤患者和正常骨髓來源的骨髓間充質(zhì)干細胞特征和的成脂肪、成骨分化能力，以及相關(guān)分化基因的表達分析，以探索其在骨髓造血干細胞微環(huán)境和急性髓系白血病病理中的功能。
　　方法：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者共10例，男性6例，女性4例，19～60歲，中位年齡44歲。其中M2四例，M3一例，M4兩例，M5一例，M6一例，未分類一例，均經(jīng)骨髓像、流式細胞術(shù)免疫分型及染色體、融合基

6、因等檢查明確診斷。非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)患者共10例，男性7例，女性3例，34～77歲，中位年齡50歲。其中8例B細胞性淋巴瘤，2例T細胞性淋巴瘤，均經(jīng)病理檢查診斷明確。骨髓正常對照3例，均為男性，19～33歲，中位年齡26歲。選擇每例患者髂后上嵴處抽出骨髓2.5 ML注入EDTA抗凝管中，5ML DPBS稀釋骨髓液，加入3.5ML Ficoll分離液中，2000rpm離心20min，吸取中間

7、交界面單個核細胞層，貼壁培養(yǎng)得到梭形骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)。流式細胞儀鑒定MSCs陽性表面標記CD105、CD73、CD90，陰性表面標記CD45。培養(yǎng)液誘導法誘導MSCs成脂肪成骨分化，并于第14天染色。AML，NHL患者和對照組取誘導成骨、成脂肪之前和第3、7天為時間點，提取mRNA，進行Real-timePCR檢測成脂肪基因脂蛋白酯酶基因(Lipoprot

8、ein lipase，LPL)，成骨基因骨橋蛋白基因(Osteopontin，OPN)。
　　結(jié)果：來源于AML患者/NHL患者/正常對照的MSCs培養(yǎng)在相同培液中，原代培養(yǎng)時MSCs呈現(xiàn)紡錘形形態(tài)且有部分圓形懸浮細胞，AML患者細胞形態(tài)與其它兩組相比更呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，分支增加，有不少扁圓形細胞。培養(yǎng)四代后的三組細胞都呈現(xiàn)相似的長梭形形態(tài)。流式細胞分選顯示細胞表面MSCs標記CD105、CD73、CD90呈陽性，而細胞表面非MSC

9、s標記CD45呈陰性。三組細胞脂肪誘導后，第3天只有AML組看到有脂滴出現(xiàn)。第7天AML組脂滴數(shù)高于其他兩組。14天油紅O染色顯示三組沒有區(qū)別。脂蛋白酯酶LPL是常用的脂肪細胞標志基因。RT-PCR結(jié)果顯示，AML組和NHL組誘導之后第三天和第七天都顯著上升。未誘導前，AML患者比NHL患者成脂肪基因LPL表達顯著增加(p＜0.05)，而與正常對照之間則沒有顯著差別;成脂肪誘導后后的第3天，第7天三組間的LPL的表達沒有區(qū)別。另一方面，

10、AML患者與正常對照各個時間點都沒有顯著區(qū)別。成骨誘導后，14天的成骨的染色AML患者弱于其他兩組，但成骨基因OPN的表達在三組之前和各個時期都沒有區(qū)別。
　　結(jié)論：AML患者的MSCs原代培養(yǎng)時形態(tài)更不規(guī)則。成脂肪誘導之前LPL表達顯著增加，誘導之后AML組更早出現(xiàn)脂滴，早期脂滴數(shù)量更多。成骨誘導14天成骨染色AML組弱于其他兩組。
　　第二部分急性髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤患者骨髓間充質(zhì)干細胞粘附分子表達水平比較及臨床意

11、義
　　目的：分析急性髓系白血病患者與非白血病的非霍奇金淋巴瘤患者和正常對照來源的骨髓間粘附分子的表達水平和誘導分化后的變化，以探索其在骨髓造血干細胞微環(huán)境和急性髓系白血病病理中的功能。
　　方法:急性髓系白血病患者共10例，男性6例，女性4例，19～60歲，中位年齡44歲。其中M2四例，M3一例，M4兩例，M5一例，M6一例，未分類一例，均經(jīng)骨髓像、流式細胞術(shù)免疫分型及染色體、融合基因等檢查明確診斷。非霍奇金淋巴瘤患者共1

12、0例，男性7例，女性3例，34～77歲，中位年齡50歲。其中8例B細胞性淋巴瘤，2例T細胞性淋巴瘤，均經(jīng)病理檢查診斷明確。骨髓正常對照3例，均為男性，19～33歲，中位年齡26歲。選擇每例患者髂后上嵴處抽出骨髓2.5 ML注入EDTA抗凝管中，5ML DPBS稀釋骨髓液，加入3.5ML Ficoll分離液中，2000rpm離心20min，吸取中間交界面單個核細胞層，貼壁培養(yǎng)得到梭形MSCs。流式細胞儀鑒定MSCs陽性表面標記CD105、

13、CD73、CD90，陰性表面標記CD45。培養(yǎng)液誘導法誘導MSCs成脂肪成骨分化，AML，NHL患者和正常對照取誘導成骨、成脂肪之前和第3、7天為時間點，提取mRNA，進行Real-time PCR檢測粘附分子E-Cadherin/N-Cadherin。
　　結(jié)果:未誘導前，AML患者、NHL患者粘附分子和對照組E-cadherin表達無顯著差別。成脂肪誘導后，AML患者第3天，第7天E-cadherin的表達顯著降低(p＜0.0

14、5);第3天AML患者E-cadherin的表達顯著小于對照組。成骨誘導后第7天NHL患者和對照組的E-cadherin的表達顯著增高(p＜0.05)。第7天AML患者E-cadherin的表達顯著高于對照組。與此相對的是N-Cadherin的表達在各個時期各組之間都沒有區(qū)別。
　　結(jié)論:AML患者在成脂肪誘導后E-cadherin表達顯著降低，在第3天AML患者E-cadherin的表達顯著小于對照組;成骨誘導后第7天NHL患者

15、和對照組的E-cadherin的表達顯著降低。而第7天AML患者E-cadherin的表達顯著高于對照組。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn):AML患者的MSCs原代培養(yǎng)時形態(tài)更不規(guī)則。成脂肪誘導之前LPL表達顯著增加，誘導之后AML組更早出現(xiàn)脂滴，早期脂滴數(shù)量更多。成骨誘導14天成骨染色AML組弱于其他兩組。AML患者在成脂肪誘導后E-cadherin表達顯著降低，在第三天AML患者E-cadherin的表達顯著小于對照組;成骨誘導后第