三氧化二砷誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌細(xì)胞凋亡與ROS相關(guān)的線粒體通路機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)屬于常見的惡性腫瘤之一,它在全球范圍內(nèi)影響著人類的健康,縮短了患者的生存時(shí)間,降低了其生活質(zhì)量。其發(fā)病率在惡性腫瘤中位居世界第五,死亡率位居世界第三,每年有一百萬的新增病例。HCC具有侵襲性強(qiáng)、瘤體增長迅速、對(duì)化療抵抗、術(shù)后復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。近年來,盡管有新的化療藥物和治療策略的廣泛應(yīng)用,但是,對(duì)于HCC的治療仍不理想。因此,如何增加患者的生存期,提高患者的生存質(zhì)量,以

2、及如何更加有效的治療HCC,已經(jīng)變得十分迫切與必要。
　　三氧化二砷(Arsenic trioxide,As203)是中國傳統(tǒng)中藥——砒霜的有效成分。早在上世紀(jì)70年代,As2O3就已經(jīng)作為治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)的臨床藥物。近年來,大量研究證實(shí)As2O3對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外都有作用,尤其是在肝癌細(xì)胞中,進(jìn)一步被證實(shí)有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。相關(guān)的機(jī)制研究表明

3、,肝癌細(xì)胞的凋亡與線粒體通路有關(guān)。經(jīng)研究表明,As2O3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡時(shí),會(huì)有大量的活性氧產(chǎn)生(reactive oxygen species,ROS),然而,當(dāng)加入抗氧化劑 N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)后,可以抑制 As203誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。As2O3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過激活線粒體通路,且可以抑制Bcl-2蛋白的表達(dá),增加Bax蛋白的表達(dá),同時(shí)釋放細(xì)胞色素C(cytochrome c,

4、cyt c)進(jìn)入到了細(xì)胞質(zhì)內(nèi),從而激活半胱氨酸天冬氨酸特異性酶(Cysteine aspartic acid specific protease,caspase),進(jìn)而可以進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終引起細(xì)胞的凋亡。Smac與cyt c一樣,同為線粒體蛋白,其引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制為通過抑制凋亡抑制蛋白(Inhibitors of apoptosis protein,IAP),消除其對(duì)caspase的抑制作用,從而使caspase進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中,發(fā)揮

5、作用,最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。為了進(jìn)一步探討 As2O3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的線粒體通路,以及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,我們選取兩個(gè)常用的HCC細(xì)胞系,分別進(jìn)一步探討As2O3是否通過調(diào)節(jié)ROS介導(dǎo)的線粒體通路發(fā)揮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用,以及 As2O3是否通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)從而發(fā)揮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　【目的】：
　　1.培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系,分別為SMMC-7721細(xì)胞系及HepG2細(xì)胞系。
　　2.探討As2O3是

6、否可以將肝癌細(xì)胞的增殖所抑制并且誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。
　　3.探討As2O3是否通過ROS介導(dǎo)的線粒體通路發(fā)揮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　4.探討As2O3是否通過調(diào)節(jié)相關(guān)線粒體蛋白的表達(dá)從而發(fā)揮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　【方法】：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組:
　　(1) SMMC-7721肝癌細(xì)胞系,人肝癌細(xì)胞系置于含有10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基,并放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后換液,48 h后用胰蛋

7、白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,將其隨機(jī)分為4組,分別加入含有0、5、10、20μM As2O3的培養(yǎng)液,被隨機(jī)分為了4組。
　　(2) HepG2肝癌細(xì)胞系,將人肝癌細(xì)胞系HepG2置于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,并放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),24h后換液,48h后用胰蛋白酶消化且將其傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,隨機(jī)分為5組,分別加入0、2、5、15μM As2O3的新鮮培養(yǎng)液,第5組加入15μM As2O3的新鮮培養(yǎng)液

8、前需要用10mM的NAC預(yù)處理1h。從而將HepG2肝癌細(xì)胞系隨機(jī)分為5組。
　　2.噻唑藍(lán)還原法(MTT法)觀察As2O3對(duì)肝癌細(xì)胞活性的影響。
　　3.Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　5.DCFH-DA活性氧檢測(cè)試劑盒測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS的量。
　　6.Rhodamine123檢測(cè)線粒體膜電位的變化。
　　7.蛋白免疫印記(Western

9、Blot)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白水平的表達(dá)。
　　【結(jié)果】：
　　1.MTT法顯示:
　　(1)肝癌細(xì)胞的活力隨著As2O3濃度的增加及用藥時(shí)間的延長,而呈現(xiàn)的是遞減的趨勢(shì)。濃度為5μmol/L的AS2O3作用于肝癌細(xì)胞48h后,細(xì)胞活力有所下降(94.23±1.52%,P<0.05);濃度為10μmol/L的AS2O3作用于肝癌細(xì)胞后72h后,細(xì)胞活力明顯下降(78.21±1.73%,P<0.01);而當(dāng)濃度為20μmo

10、l/L的AS2O3作用于肝癌細(xì)胞后72h后,細(xì)胞活力仍明顯下降(49.65±0.83%,P<0.01)。
　　(2)肝癌細(xì)胞的活力是隨著As2O3濃度的增加及用藥時(shí)間的延長,而呈現(xiàn)的是遞減的趨勢(shì)。濃度為5μmol/L的AS2O3作用于肝癌細(xì)胞48h后,細(xì)胞活力有所下降(78.12±1.51%,P<0.01);濃度為15μmol/L的AS2O3作用于HepG2細(xì)胞后72h后,細(xì)胞活力明顯下降(59.13±1.72%,P<0.01)。

11、然而,當(dāng)給予抗氧化劑 NAC阻斷之后,細(xì)胞活力下降的趨勢(shì)則被抑制,與高劑量組比較,作用于72h后,細(xì)胞活力上升至(84.23±2.12%,P<0.01)。
　　2.Hoechst3325染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化顯示:
　　(1)在原發(fā)性肝癌SMMC-7721細(xì)胞中,隨著As2O3濃度的增加,各組出現(xiàn)的凋亡征象也就越發(fā)地明顯。在給予5、10、20μmol/L的As2O3處理SMMC-7721細(xì)胞后,核固縮,染色質(zhì)凝聚的細(xì)胞

12、數(shù)分別增加到(11.23±1.52%,P<0.01),(23.22±2.29%,P<0.01),(42.45±3.17%,P<0.01)。
　　(2)在原發(fā)性肝癌 HepG2細(xì)胞中,隨著 As2O3濃度的增加,各組出現(xiàn)的凋亡征象也就越發(fā)地明顯。在給予2、5、15μmol/L的As2O3處理HepG2細(xì)胞后,核固縮,染色質(zhì)凝聚的細(xì)胞數(shù)分別增加到(17.73±0.91%,P<0.01),(24.23±2.21%,P<0.01),(47

13、.54±2.92%,P<0.01)。然而,當(dāng)給予抗氧化劑 NAC阻斷之后,凋亡的細(xì)胞則會(huì)減少,與高劑量組比較,核固縮,染色質(zhì)凝聚的細(xì)胞數(shù)減少到(19.77±2.12%,P<0.01)。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示:
　　(1)在原發(fā)性肝癌SMMC-7721細(xì)胞中,隨著As2O3劑量的增加,各組細(xì)胞凋亡率和壞死率呈逐漸增加的趨勢(shì),同時(shí),活細(xì)胞率則會(huì)越來越少。在給予5、10、20μmol/L的As2O3處理肝癌細(xì)胞后,細(xì)

14、胞的凋亡比例從1.94±0.58%(未用As2O3處理的細(xì)胞)增加至(23.67±2.19%,P<0.01),(39.22±1.95%,P<0.01),(54.23±2.46%,P<0.01)。
　　(2)在原發(fā)性肝癌 HepG2細(xì)胞中,隨著 As2O3劑量的增加,各組細(xì)胞凋亡率和壞死率呈逐漸增加的趨勢(shì),同時(shí),活細(xì)胞率則會(huì)越來越少,呈劑量依賴性。在給予2、5、15μmol/L的As2O3處理HepG2細(xì)胞后,細(xì)胞的凋亡比例從2.8

15、2±0.55%(未用As2O3處理的細(xì)胞)增加至(18.91±2.77%,P<0.01),(38.75±1.92%,P<0.01),(59.18±1.79%,P<0.01)。然而,當(dāng)給予抗氧化劑 NAC阻斷之后,凋亡的細(xì)胞則會(huì)減少,與高劑量組比較,細(xì)胞凋亡的數(shù)目減少到(13.1±2.13%,P<0.01)。
　　4.測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的量:
　　(1)隨著 As2O3量的增加,細(xì)胞內(nèi) ROS產(chǎn)生的量也是隨之增加的,呈現(xiàn)出劑

16、量依賴的關(guān)系。在給予5、10、20μmol/L的As2O3處理SMMC-7721細(xì)胞后,檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi) ROS的量,分別是對(duì)照組的1.2倍(P<0.05),2.1倍(P<0.01),3.2倍(P<0.01)。
　　(2)隨著 As2O3量的增加,細(xì)胞內(nèi) ROS產(chǎn)生的量也隨之增加,呈現(xiàn)出劑量依賴的關(guān)系。在給予2、5、15μmol/L的As2O3處理HepG2細(xì)胞后,檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)ROS的量,分別是對(duì)照組的1.1倍(P<0.05),1

17、.8倍(P<0.01),3.2倍(P<0.01)。然而,當(dāng)給予抗氧化劑NAC阻斷之后,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS的量會(huì)減少,與高劑量組比較,細(xì)胞內(nèi)ROS的量減少到高劑量組的0.33倍(P<0.01)。
　　5.線粒體膜電位(△ψm)的測(cè)定:
　　(1)隨著As2O3用藥量的增加,檢測(cè)到的線粒體膜電位是呈下降的趨勢(shì),呈劑量依賴的關(guān)系。在給予5、10、20μmol/L的As2O3處理SMMC-7721細(xì)胞后,線粒體膜電位下降的量,分別是

18、空白對(duì)照組的0.91倍(P<0.05),0.73倍(P<0.01),0.52倍(P<0.01)。
　　(2)隨著As2O3用藥量的增加,檢測(cè)到線粒體膜電位是下降趨勢(shì),呈劑量依賴的關(guān)系。在給予2、5、15μmol/L的As2O3處理HepG2細(xì)胞后,線粒體膜電位下降的量,分別是空白對(duì)照組的0.95倍(P<0.05),0.74倍(P<0.01),0.53倍(P<0.01)。然而,當(dāng)給予抗氧化劑NAC阻斷之后,線粒體膜電位減少的趨勢(shì)則會(huì)

19、被抑制,與高劑量組比較,線粒體膜電位上升的量是高劑量組的1.64倍(P<0.01)。
　　6.Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白水平的表達(dá)顯示:
　　(1)在SMMC-7721細(xì)胞中,細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2的比值隨著As2O3濃度的增加而上調(diào),具體而言,Bax蛋白的表達(dá)量上調(diào),Bcl-2蛋白的表達(dá)量下調(diào)。同樣,隨著As2O3濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)cyt c、Smac、caspase-3、caspase-6、caspas

20、e-9蛋白的表達(dá)量均上調(diào),呈劑量依賴關(guān)系,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)在HepG2肝癌細(xì)胞系中,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-6、caspase-9蛋白的表達(dá),三種蛋白的表達(dá)均呈上升趨勢(shì),且呈劑量依賴性。然而,當(dāng)加入抗氧化劑NAC之后,三種蛋白的表達(dá)量上升的趨勢(shì)則被抑制。用Western Blot法檢測(cè)cyt c、Smac的表達(dá)呈上升的趨勢(shì),Bax/Bcl-2的比值同樣呈上升的趨勢(shì),Bax蛋白的表達(dá)量上調(diào),B