原發(fā)性肝癌術(shù)后早期復發(fā)密切相關(guān)microRNA的篩選及應(yīng)用.pdf

1、背景與目的:肝癌是目前世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率分別為第七位和第五位，我國衛(wèi)生部統(tǒng)計得出肝癌死亡率占腫瘤死亡率的第二位。肝癌分原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)、膽管細胞癌（cholangio carcinoma ICC）和混合細胞癌。其中肝細胞肝癌占90％以上。手術(shù)切除和肝臟移植是目前肝癌治療最有效的手段，但術(shù)后高復發(fā)率嚴重影響患者預后，有些患者即便行根治性肝

2、癌切除術(shù)后仍可能復發(fā)，這些和肝癌的生物學特性有關(guān)。大量文獻及既往臨床研究證實:肝癌根治性切除術(shù)后第1年內(nèi)復發(fā)率最高，而且復發(fā)患者的預后也較其他惡性腫瘤晚期復發(fā)的患者差。因此肝癌術(shù)后早期復發(fā)已經(jīng)成為影響患者預后的重要因素。從肝癌早期復發(fā)的生物學特性開始研究，找出影響肝癌發(fā)生的關(guān)鍵信號通路及靶基因，有利于更早預測診斷肝癌高危人群，并采取相應(yīng)地有效措施來提高肝癌根治性的可切除術(shù)率，確保手術(shù)療效。
　　 傳統(tǒng)的肝癌治療的方法有一定的滯后

3、性。因此，有必要結(jié)合引響肝癌發(fā)生、發(fā)展過程的多因素，運用基因組群分析方法從分子水平上發(fā)現(xiàn)肝癌復發(fā)及侵襲轉(zhuǎn)移機制。找出與肝癌復發(fā)侵襲相關(guān)的敏感基因作為治療肝癌的分子靶標，為臨床上根治肝癌帶來新的思路。
　　 MicroRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子RNA，是哺乳動物基因組中最為豐富的調(diào)節(jié)基因之一，預測其可能調(diào)控著至少三分之一的人類編碼基因而miRNA本身并不編碼蛋白，它通過與特異的靶mRNA結(jié)合，降解或抑制其翻譯過程，從而降低相

4、應(yīng)靶基因的表達調(diào)控。到目前為止人類發(fā)現(xiàn)了1000多個miRNAs，其中已被證實的miRNA就達500多個。miRNA的具體如何調(diào)控調(diào)節(jié)靶蛋白的翻譯目前尚不清楚。隨著對miRNA功能研究的深入，越來越多的研究表明miRNA與人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特別是在腫瘤的發(fā)生、復發(fā)、轉(zhuǎn)移、侵襲中起到關(guān)鍵作用，目前已經(jīng)是腫瘤研究的熱點之一。
　　 近期的研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的腫瘤有不同組合的miRNAs異常表達譜，提示腫瘤的miRNAs表達

5、具有其組織特異性。有學者研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-18、precursor miR-18、miR-224較正常組織有更高水平的表達，miR-199a、miR-195、miR-200a、miR-125a較正常組織有低水平表達。而在大鼠肝癌組織中，let-7a、miR-21、miR-23、miR-130、miR-190、miR-17-92都有表達水平的上調(diào)，但肝組織富集的miR-122在癌組織中表達水平明顯下調(diào)。上述異常表達的miRNA在功

6、能分析研究中顯示可能與肝癌細胞的分化、信號轉(zhuǎn)導相關(guān)。
　　 miRNA是完全天然的內(nèi)源性反義調(diào)節(jié)因子，基于miRNA的基因治療可能成為抑制腫瘤惡化的有效途徑。目前有關(guān)肝癌的研究報道主要集中于模擬內(nèi)源性miRNA，增強其對靶基因的作用效能;或以miRNA為靶點設(shè)計小分子物質(zhì)拮抗miRNA的作用，如miRNA反義寡聚（脫氧）核苷酸(anti-miRNA oligonucleotides，AMOs)、鎖定核酸修飾的寡核苷酸(locke

7、d nucleic acid，LNA-modified oligonucleotides)以及miRNA拮抗分子(antagomis)等。而針對目標基因設(shè)計靶向特異性miRNA作用于肝癌細胞方面的研究，國內(nèi)外尚未見報道。
　　 最近有數(shù)據(jù)表明某些特定作用的microRNA在腫瘤細胞內(nèi)的過表達或缺失與臨床上不同亞型的腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與侵襲性功能密切相關(guān)。研究表明mir-144在許多腫瘤中表達失控。如乳腺癌、白血病、肝癌、少突角質(zhì)細胞

8、瘤等疾病中異常表達。另外，mir-144通過下調(diào)Rb1通路途徑發(fā)揮乳腺癌細胞的增殖效應(yīng)。眾多的數(shù)據(jù)表明mir-144在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c和miR-200b通過鋅指結(jié)構(gòu)的E-盒結(jié)合同源異型盒(zinc-finger E-box binding homeobox，ZEB)來上調(diào)E-cadherin表達抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchchymal tr

9、ansition，EMT)。值得研究的是ZEB1和ZEB2也能與miR-200家族上游的啟動子E-box或Z-box結(jié)合抑制miR-200家族的轉(zhuǎn)錄。提示:miR-200家族與靶基因ZEB之間互相通過負反饋調(diào)節(jié)二者之間的表達平衡。miRNA在腫瘤中有可能起促癌作用也有可能起抑癌作用，甚至在微環(huán)境條件變化下既起癌基因作用又起抑癌基因的作用。Let-7家族、miR-206、miR-335在乳腺癌中起抑癌作用;miR-378、miR-373、

10、miR-21、miR-10b等在乳腺癌中起促癌作用。目前有關(guān)與肝癌相關(guān)miRNA的研究很多，而與肝癌術(shù)后早期復發(fā)相關(guān)。miRNA表達譜及miRNA在肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機制尚不清楚。
　　 國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)mir-144在肝癌腫瘤中表達下調(diào)，其異常表達在多種腫瘤中得到證實。推測mir-144可能在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。為進一步研究mir-144在肝癌中的作用，本研究通過microRNA基因芯片篩選出mir-144在肝癌中表達上調(diào)

11、，初步證實mir-144在肝癌中發(fā)揮促癌基因的作用。在以后的研究中將mir-144作為肝癌治療的靶點，為肝癌的分子分型及臨床診治提供新的思路。
　　 MicroRNA通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白來發(fā)揮促癌以及抑癌作用，有學者提出在正常細胞中生理濃度的microRNA抑制調(diào)節(jié)細胞周期靶蛋白的表達。當microRNA表達過高就抑制細胞周期靶蛋白的調(diào)節(jié)，阻止細胞周期分化，細胞處于癌變低分化狀態(tài)。有關(guān)microRNA在肝癌中的研究報道[11]:

12、miR-195抑制其對應(yīng)的靶基因細胞周期蛋白CDK6和D1而抑制肝癌細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化。而且miR-195通過抑制RB蛋白的磷酸化而阻止下游靶基因的活化。提示:miR-195在肝癌產(chǎn)生的分子機制方面以及細胞周期調(diào)節(jié)方面具有潛在的意義。
　　 由于腫瘤組織的特異性，使得miRNA引響到腫瘤的分子分型，并在臨床疾病診治方面顯得尤為重要。而隨著腫瘤相關(guān)miRNAs及其靶基因的發(fā)現(xiàn)以及分子機制的研究使得有些問題值得研究者思考:在整個

13、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中miRNA只是起間接調(diào)控作用，它并不是單一或某些特定基因的表達產(chǎn)物。一個miRNA可同時或同步調(diào)節(jié)多個靶基因的表達，如果只是改變單個miRNA可能會影響到其他未知的靶基因。相反，單一的靶基因也可能同時或同步被多個miRNA調(diào)控。單一的miRNA可能不足以影響到特定靶基因的表達。因此，目前把miRNA應(yīng)用于臨床診斷和治療還為時尚早，但對miRNA具體作用機制以及對靶基因的調(diào)控還需進一步更加細致深入的研究。
　　 第一

14、部分microRNA芯片技術(shù)在肝癌術(shù)后早期復發(fā)相關(guān)microRNA的篩選研究
　　 目的:利用microRNA芯片技術(shù)分析比較兩組不同復發(fā)傾向肝癌組織miRNA表達譜的差異，獲得與原發(fā)性肝癌早期復發(fā)密切相關(guān)的microRNAs
　　 方法:
　　 通過對行肝癌切除患者術(shù)前簽署知情同意書，收集2002年至2010年于我院接受肝癌根治性手術(shù)治療的原發(fā)性肝細胞癌患者的手術(shù)標本500余例。建立了一套數(shù)據(jù)完整肝癌標本庫系統(tǒng)

15、，并制定完整的肝癌患者登記表且收集患者臨床各項病歷資料及隨訪資料。標本收集好之后迅速轉(zhuǎn)至超低溫冰箱長期凍存，把所收集的標本及臨床資料統(tǒng)一編號，及時備案?，F(xiàn)從我院肝癌數(shù)據(jù)標本庫中挑選10例原發(fā)性肝癌深低溫凍存組織標本。其中5例早期復發(fā)組（5例術(shù)后1年內(nèi)肝內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)病灶）;5例非早期復發(fā)組（5例術(shù)后超過2年未出現(xiàn)肝內(nèi)復發(fā)病灶）。首先采用分子生物學方法提取兩組肝癌組織總RNA并行CY3標記;然后將所標記后的RNA與Agilent公司的miRN

16、A芯片上進行雜交反應(yīng);再利用SAM2.1軟件進行分析篩選。采用Cluster3.0對差異表達的miRNA聚類分析。
　　 結(jié)果:本研究通過芯片實驗共篩選獲得7個差異表達的microRNAs，其中4個表達上調(diào)，分別為mir-602、mir-451、mir-144、mir-486-5p表達上調(diào)。（其中mir-602上調(diào)2.29倍、mir-451上調(diào)3.73倍、mir-144上調(diào)5.28倍、mir-486-5p上調(diào)2.5倍，所用的P＜

17、0.05）;3個表達下調(diào)分別為mir-551b、mir-96、mir-502-3p表達下調(diào)。（其中mir-551b下調(diào)0.21倍、mir-96下調(diào)0.12倍、mir-502-3p下調(diào)0.042倍所有的P＜0.05）
　　 結(jié)論:利用microRNA基因芯片能快速、高通量的篩選出與原發(fā)性肝癌術(shù)后早期復發(fā)密切相關(guān)的mircroRNA，該研究為基于肝癌相關(guān)microRNA的基因治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分實時熒光定量PCR

18、技術(shù)(qRT-PCR)檢測mir-144、mir-502-3p在肝癌組織中相對表達水平
　　 目的:運用qRT-PCR技術(shù)在大樣品的基礎(chǔ)上驗證miRNA基因芯片所預測mir-144、mir-502-3p在肝癌早期復發(fā)組與非早期復發(fā)組之間miRNA表達水平的差異。
　　 方法:從我院肝癌數(shù)據(jù)標本庫中挑選82例原發(fā)性肝癌深低溫凍存組織標本。其中50例早期復發(fā)組（50例術(shù)后1年內(nèi)肝內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)病灶）;32例非早期復發(fā)組（32例術(shù)

19、后超過2年未出現(xiàn)肝內(nèi)復發(fā)病灶）。利用分子生物學方法提取總RNA，以U6為內(nèi)參基因。分別合成mir-144、mir-503-3p和U6的特異性的引物，以SYBR Green染料法對mir-144、mir-502-3p、U6的特異性擴增引物行qRT-PCR實時熒光檢測。結(jié)果運用ABIsds2.1軟件分析，繪制擴增曲線、溶解曲線。計算比較早期復發(fā)組與非早期復發(fā)組兩組間mir-144、mir-502-3p在肝癌中表達的相對表達量的差異。

20、　　 結(jié)果:qRT-PCR實驗結(jié)果與miRNA芯片篩選的結(jié)果一致。qRT-PCR結(jié)果顯示:mir-144、mir-502-3p兩基因引物的擴增產(chǎn)物均為單峰。mir-144在早期復發(fā)組比非早期組上調(diào)6.944倍，mir-502-3p在早期復發(fā)組比非早期復發(fā)組下調(diào)0.253倍。兩組比較在統(tǒng)計學上均有顯著的差異。利用生物信息學方法預測miR-144靶基因可能為Rb1，miR-502-3p靶基因可能為SET。
　　 結(jié)論: mir-1