格爾德霉素對(duì)RIP1介導(dǎo)的缺糖缺氧后大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元Necroptosis的保護(hù)機(jī)制.pdf

1、目的：探討格爾德霉素對(duì)缺糖缺氧誘導(dǎo)的原代皮質(zhì)神經(jīng)元Necroptosis是否有保護(hù)作用，并深入研究其作用機(jī)制是否與RIP1存在相關(guān)性。
　　 方法：SD大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)14天，zVAD-fmk預(yù)處理30min，缺糖缺氧2小時(shí)，復(fù)灌不同時(shí)間觀察RIP1蛋白量變化并選擇表達(dá)量高峰時(shí)間點(diǎn)為復(fù)灌時(shí)間；不同濃度的格爾德霉素(GA)預(yù)作用不同的時(shí)間后，zVAD-fmk預(yù)作用30min阻斷Caspase依賴的凋亡途徑，缺糖缺氧(OG

2、D)2小時(shí)復(fù)灌8小時(shí)，通過(guò)westem blot、免疫熒光半定量、定性檢測(cè)RIP1蛋白量變化，LDH測(cè)定細(xì)胞受損程度；GA不同濃度以及預(yù)作用不同時(shí)間，測(cè)定LDH及相應(yīng)的RIP1蛋白水平的變化；通過(guò)western blot觀察GA預(yù)作用后HSP90蛋白水平的變化；隨后實(shí)驗(yàn)組分為OGD、OGD+zVAD以及OGD+zVAD+GA組，免疫沉淀RIP1，檢測(cè)HSP90及RIP1蛋白水平變化，并結(jié)合免疫熒光定性觀察；應(yīng)用GA類似物Geldampi

3、cin(GE)，觀察其對(duì)RIP1、HSP90表達(dá)水平是否有影響；通過(guò)RT-PCR觀察GA預(yù)作用后RIP1基因表達(dá)情況變化。
　　 結(jié)果：隨著缺糖缺氧后復(fù)灌時(shí)間的延長(zhǎng)，RIP1蛋白表達(dá)量逐漸增加，8小時(shí)達(dá)到最高水平，與LDH檢測(cè)的細(xì)胞受損程度相對(duì)應(yīng)（P＜0.05）；隨著GA濃度的增高及預(yù)作用時(shí)間的延長(zhǎng)，RIP1蛋白水平、LDH逐漸降低，當(dāng)GA濃度大于1.0μmol/L，預(yù)作用時(shí)間超過(guò)8h,LDH水平逐漸升高(P＜0.05);GA可

4、以引起HSP90蛋白量降低，免疫沉淀結(jié)果顯示隨著GA的作用可以使RIP1及與之結(jié)合的HSP90蛋白水平均降低，而GE則對(duì)兩者均無(wú)影響；RT-PCR檢測(cè)RIP1基因水平，與DMSO組對(duì)比，在GA濃度為0.1μmol/L和2.0μmol/L時(shí)基因水平無(wú)明顯變化（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：RIP1和HSP90以復(fù)合物的形式存在于胞質(zhì)中并介導(dǎo)Necroptosis的發(fā)生；GA對(duì)細(xì)胞RIP1基因的表達(dá)沒(méi)有影響，而是通過(guò)HSP90這一靶