紫杉醇或γ線放射介導的自噬現(xiàn)象對Folliculin基因缺陷腎癌細胞放化療敏感性影響的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分:抑制自噬可增強紫杉醇對Folliculin基因缺陷腎癌細胞的毒性作用
  研究背景:
  腎癌約占成人惡性腫瘤的2%-3%,其中大部分為散發(fā)性腎癌,約4%的病例為遺傳性腎癌。了解遺傳性腎癌的發(fā)病機制對腎癌治療有著重要的意義,目前已明確的遺傳性腎癌包括:①VHL綜合征;②遺傳性乳頭狀腎癌;③遺傳性平滑肌瘤病腎癌;④BHD(Birt-Hogg-Dube)綜合征。BHD綜合征是一種常染色體顯性遺傳病,其臨床主要表現(xiàn)為多發(fā)

2、性纖維毛囊瘤,多發(fā)性肺囊腫,自發(fā)性氣胸及腎臟腫瘤。BHD綜合征由folliculin(FLCN)基因缺失突變引起,研究表明FLCN基因位于常染色體17p11.2,編碼含579個氨基酸的FLCN蛋白。FLCN蛋白與FNIP1、FNIP2蛋白相結合,參與調節(jié)mTOR和AMPK信號通路,但其具體功能尚需進一步研究。
  對于BHD綜合征伴發(fā)的雙側腎癌,目前尚無標準的治療方法。2006年YoufengYang等建立了第一個源自BHD腎癌患

3、者的腎癌細胞系UOK257,2011年XiaohongLu等建立了穩(wěn)定表達FLCN蛋白的細胞系UOK257-2,并發(fā)現(xiàn)化療藥物紫杉醇對UOK257細胞的殺傷作用明顯強于UOK257-2,但并未深入研究這一現(xiàn)象的作用機制。我們的研究結果表明,相對于高表達FLCN蛋白的腎癌細胞,紫杉醇在FLCN缺失或下調的腎癌細胞中具有更強的細胞毒性作用,并可誘導更多的凋亡和自噬現(xiàn)象。
  自噬又被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡,其特征為細胞質內出現(xiàn)包裹長壽

4、命的細胞器或蛋白的雙層膜結構(自噬體),并通過自噬體與溶酶體融合的途徑將其分解消化的一系列生化反應。自噬對維持細胞穩(wěn)態(tài)有重要的意義,在細胞遭遇饑餓等應激情況下,細胞可以通過自噬清除受損的蛋白或細胞器并維持代謝,因此自噬被認為是細胞在應激環(huán)境下所產(chǎn)生的一種自我保護性反應;于此同時,自噬也是細胞程序性死亡的一種方式,抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路可以明顯激活肺癌細胞

5、和肝癌細胞的自噬反應并抑制細胞生長。大量研究表明,自噬對腫瘤細胞生長產(chǎn)生促進或抑制作用取決于腫瘤的種類以及外界刺激等各種因素。正確的選擇自噬激活劑或抑制劑,從而加強細胞的自噬性死亡或抑制細胞的保護性自噬,可以增強抗癌藥物對腫瘤細胞的殺傷作用并提高對腫瘤的治療效果,因此有必要深入研究藥物對腫瘤自噬的影響,以及所誘導自噬的種類。我們的研究結果表明,紫杉醇可以誘導FLCN缺失或下調的腎癌細胞產(chǎn)生保護性自噬,而應用自噬抑制劑3-MA可以明顯強化

6、紫杉醇的細胞毒作用。
  研究表明,紫杉醇可以在不同的腫瘤細胞中誘導凋亡,但其是否能在細胞中誘導自噬尚存在爭議。為了確認紫杉醇可以在FLCN缺失腎癌細胞中誘導自噬反應,我們除了應用UOK257/UOK257-2細胞外,還以腎癌細胞系ACHN作為對照,建立了FLCN表達下調的腎癌細胞系ACHN5968。我們的研究結果表明,紫杉醇可以在FLCN缺失或下調的腎癌細胞中誘導自噬,但在FLCN高表達的細胞中自噬水平無明顯變化,聯(lián)合應用自噬抑

7、制劑和紫杉醇可能成為治療BHD腎癌的一條有效途徑。
  目的:
  研究紫杉醇誘導的自噬現(xiàn)象對FLCN缺失或下調的腎癌細胞的影響及其分子機制,探討聯(lián)合應用自噬抑制劑和紫杉醇對BHD綜合征伴發(fā)腎癌的治療效果。
  材料與方法:
  1.細胞
  本實驗使用2組細胞:UOK257/UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc。其中UOK257不表達FLCN蛋白,UOK257-2是在UOK257細胞中轉染F

8、LCN基因并穩(wěn)定表達FLCN蛋白的細胞系;ACHN-sc是在腎癌細胞系ACHN中轉入空白質粒的細胞,ACHN5968是利用siRNA技術將ACHN中FLCN表達下調的細胞系。
  2.細胞活性及細胞凋亡的測定
  細胞活性由MTT法測定:UOK257/UOK257-2和ACHN5968/ACHN-sc細胞種于96孔板中,實驗組加入100nM紫杉醇,對照組加入等量PBS,分別在0、24、48、72小時在96孔板中加入MTT(5

9、mg/ml)并測量其OD值。細胞凋亡由TUNEL及DAPI染色法測定。TUNEL:實驗組及對照組單層細胞種于96孔板中,利用TUNEL試劑盒(HTTiterTACSTMAssay kit,TREVIGEN(@))測定凋亡細胞數(shù)量。DAPI染色:細胞經(jīng)固定后,經(jīng)過DAPI染色(利用1xPBS1:2000稀釋),于熒光顯微鏡下觀察并比較實驗組和對照組細胞核形態(tài)。另外,本組實驗還通過cleaved caspase-3蛋白的western bl

10、ot結果間接比較實驗組和對照組細胞凋亡差別。
  3.細胞自噬的檢測
  (1)電子顯微鏡觀察自噬體
  利用電子顯微鏡觀察自噬體是檢測細胞自噬的經(jīng)典方法。本組實驗中,UOK257/UOK257-2和ACHN5968/ACHN-sc細胞種于10cm培養(yǎng)皿中,實驗組加入100nM紫杉醇,對照組加入等量PBS,24小時后按透射電鏡標本制作要求制作標本,透射電鏡下觀察并拍照。電鏡下自噬體特征為雙層膜結構,自噬體內有時可觀察到

11、未消化的包漿成分或殘存的細胞器。
  (2)GFP-LC3免疫熒光分析
  微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)位于自噬體膜上,與自噬體數(shù)量密切相關。通過免疫熒光的方法可以觀察到自噬誘導后的GFP-LC3點狀聚集增多。本組實驗中,各組細胞轉染GFP-LC3質粒,24小時后加入100nM紫杉醇或PBS,再過24小時后于熒光顯微鏡下觀察細胞內

12、熒光顆粒,并計算平均每組細胞內熒光顆粒的數(shù)量。
  (3)單丹磺酰戊二胺熒光分析
  單丹磺酰戊二胺(monodansyl cadaverine,MDC)可以使自噬體發(fā)出藍色熒光,從而成為觀察自噬的一種輔助方法。本組實驗中,各組細胞種于6孔板中,加入0.05mMMDC并在37℃條件下等待20分鐘,然后固定細胞并于熒光顯微鏡下觀察細胞內熒光顆粒,計算平均每組細胞內熒光顆粒的數(shù)量。
  (4)LC3和P62蛋白印跡分析(w

13、estern blot)
  LC3蛋白是自噬體膜上的標記蛋白。LC3蛋白又分為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式,當自噬體形成后,LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamines,PE)結合形成LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ位于自噬體膜上,并最終隨自噬體被溶酶體降解。在實際實驗中,藥物誘導后的LC3-Ⅱ蛋白表達升高可以由自噬水平升高引起,但也可能由溶酶體功能受到抑制且自噬水平降低引起,為區(qū)分這兩種原因,一般先用溶

14、酶體抑制劑處理細胞,然后再檢測藥物誘導后的LC3-Ⅱ蛋白水平。本組實驗中,利用蛋白印跡方法檢測并比較各組細胞內LC3-Ⅱ蛋白含量,并利用溶酶體抑制劑baf(i)lomycin A1處理細胞后,再次檢測細胞內LC3-Ⅱ蛋白含量。另外,本組實驗還檢測各組細胞中P62蛋白含量,以進一步證實細胞內自噬反應。
  4.ERK信號通路的檢測
  本組實驗利用蛋白印跡方法檢測MEK,ERK及P-ERK蛋白水平,從而確定ERK信號通路的激活

15、是紫杉醇誘導缺乏FLCN表達的腎癌細胞產(chǎn)生自噬的關鍵機制。本組實驗檢測了各組細胞中FLCN,MEK,ERK,P-ERK,LC3-Ⅰ/Ⅱ及beclin-Ⅰ蛋白表達水平,并應用P-ERK抑制劑U0126處理細胞后,再次檢測P-ERK,LC3-Ⅰ/Ⅱ及beclin-Ⅰ蛋白表達變化。
  5.自噬功能的檢測
  為了判定細胞自噬對紫杉醇毒性的影響,本組實驗分別利用自噬抑制劑和基因沉默技術抑制自噬,觀察并比較自噬抑制前后紫杉醇對細胞毒

16、性作用的變化。各組細胞經(jīng)自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)處理或轉染beclin 1 siRNA后,檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表達變化,并利用MTT和TUNEL方法比較自噬抑制前后紫杉醇對細胞毒性作用的變化。
  6.統(tǒng)計學分析
  本課題利用SPSS軟件包對各組實驗數(shù)據(jù)進行方差分析或t檢驗。所有數(shù)值用平均值±標準差表示。p<0.05表示具有顯著性差異。
  結果:
  1.

17、紫杉醇對細胞活性及凋亡的影響經(jīng)紫杉醇處理后,UOK257/UOK257-2和ACHN5968/ACHN-sc細胞的細胞生長均受到抑制,與對照組細胞(UOK257-2、ACHN-sc)相比,F(xiàn)LCN缺失或下調的細胞(UOK257、ACHN5958)生長曲線下降更為明顯。TUNEL和DAPI染色結果顯示,加入紫杉醇后,與UOK257-2和ACHN-sc相比,UOK257和ACHN5968細胞凋亡更加明顯,且凋亡相關蛋白cleavedcasp

18、ase-3有顯著升高。以上實驗結果表明,與高表達FLCN的腎癌細胞相比,紫杉醇可以在FLCN缺失或下調的細胞中誘導更明顯的細胞凋亡和生長抑制。
  2.紫杉醇對細胞自噬的影響經(jīng)紫杉醇處理后,UOK257-2和ACHN-sc細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達無明顯變化,而UOK257和ACHN5968細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達明顯升高;經(jīng)溶酶體抑制劑baf(i)lomycinA1處理后各組細胞的LC3-Ⅱ表達均有所升高,相比于UOK257-2和

19、ACHN-sc細胞,UOK257和ACHN5968細胞中LC3-Ⅱ蛋白升高更加明顯。GFP-LC3和MDC分析結果顯示,與UOK257-2和ACHN-sc細胞相比,經(jīng)紫杉醇處理后UOK257和ACHN5968細胞內可見熒光點狀聚集顯著增加(p<0.05),電子顯微鏡下可見UOK257和ACHN5968細胞內出現(xiàn)較多的自噬體。以上實驗結果證明,紫杉醇可以在FLCN缺失或下調的腎癌細胞內誘導明顯的自噬現(xiàn)象。
  3.紫杉醇誘導自噬的分

20、子機制westernblot結果表明,F(xiàn)LCN蛋白參與MAPK信號通路的調節(jié)。與UOK257-2和ACHN-sc相比,UOK257和ACHN5968細胞內ERK信號通路被明顯激活,通路關鍵蛋白P-MEK和P-ERK都有顯著升高。根據(jù)文獻報道,ERK信號通路可以通過調節(jié)自噬相關蛋白Beclin-1的表達進而影響細胞自噬,本組實驗中,紫杉醇可以進一步升高UOK257和ACHN5968細胞中P-ERK和Beclin-i蛋白水平,而利用U012

21、6抑制P-ERK表達后,細胞內Beclin-i和LC3-Ⅱ水平均有明顯下降,GFP-LC3實驗結果顯示細胞內熒光點狀結構數(shù)目明顯減少。本組實驗結果證明,紫杉醇可以在FLCN缺失或下調的腎癌細胞內激活ERK通路并升高Beclin-1蛋白表達,進而誘導細胞自噬。
  4.自噬對紫杉醇藥效及細胞生長的影響經(jīng)自噬抑制劑3-MA處理細胞后,紫杉醇未能在UOK257和ACHN5968細胞中誘導自噬,加入紫杉醇后細胞LC3-Ⅱ水平無明顯改變。M

22、TT和TUNEL結果顯示,加入3-MA后,紫杉醇對UOK257和ACHN5968細胞的毒性作用明顯增強,并能在細胞內誘導更明顯的凋亡。利用基因沉默技術抑制自噬可以得到相似的結果,通過下調Beclin-1蛋白表達抑制自噬后,UOK257和ACHN5968細胞對紫杉醇更加敏感。本組實驗結果表明,紫杉醇可以在殺傷UOK257和ACHN5968腎癌細胞的同時誘導細胞內出現(xiàn)保護性自噬,聯(lián)合應用紫杉醇和自噬抑制劑可能會對BHD伴發(fā)的腎癌有更明顯的治

23、療效果。
  結論:
  1.與高表達FLCN的細胞相比,紫杉醇對FLCN缺失或下調的腎癌細胞有更明顯的細胞毒作用。
  2.紫杉醇在FLCN缺失或下調的細胞內激活ERK通路并上調Beclin1蛋白表達,進而誘導細胞自噬。
  3.抑制自噬可以增強紫杉醇對FLCN缺失或下調的腎癌細胞的毒性作用,聯(lián)合應用自噬抑制劑和紫杉醇可能成為治療BHD相關性腎癌的有效途徑。
  研究意義及創(chuàng)新性
  1.本課題實驗

24、結果首次表明紫杉醇可以在FLCN缺失或下調的腎癌細胞中誘導自噬,并進一步揭示了紫杉醇誘導自噬的分子機制為ERK通路的激活以及Beclin1蛋白表達的增強。
  2.本課題結果表明抑制自噬可以增強紫杉醇對FLCN缺失或下調的腎癌細胞的細胞毒作用,并提出聯(lián)合應用自噬抑制劑和紫杉醇可能會成為治療BHD相關性腎癌的有效途徑。
  第二部分:自噬對Folliculin基因缺陷的腎癌細胞放療敏感性的影響
  研究背景:
  

25、腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,大約有25%-30&的腎癌患者在初次診斷時就已發(fā)現(xiàn)有局部浸潤或遠處轉移。局限性腎癌首選治療方法為根治性腎切除術,但術后約1/3患者將出現(xiàn)遠處轉移。晚期腎癌預后較差,對放療和化療都不敏感。盡管最近有文獻報告重離子放療可能對腎癌有較好的治療效果,但目前臨床上放療僅被用作腎癌治療的輔助方法。研究表明腎癌的發(fā)生可能與部分抑癌基因如VHL,F(xiàn)LCN,MET等基因功能喪失有關,其中FLCN基因缺失常誘發(fā)BHD綜合

26、征,患者可伴有雙側腎腫瘤,而針對FLCN基因缺陷的腎腫瘤目前尚無有效的治療方法。本課題研究發(fā)現(xiàn),相較于其他類型的腎癌細胞,F(xiàn)LCN缺失的腎癌細胞對γ線放射更加敏感,且在經(jīng)受放射后細胞內出現(xiàn)更明顯的自噬現(xiàn)象。
  自噬是一種正常的細胞內生化反應,可以在細胞經(jīng)受饑餓等生存壓力時為細胞提供能量和營養(yǎng)成分。在腫瘤細胞中自噬水平可能出現(xiàn)異常,并根據(jù)細胞種類和外界刺激的不同,出現(xiàn)導致細胞生命力增強或者啟動細胞程序性死亡這兩種截然相反的結果。目

27、前自噬在腫瘤治療中的應用是熱門研究領域之一,而自噬對腫瘤放療敏感性的影響尚未清楚。在多項體外實驗中,自噬抑制劑氯喹可以明顯增強腫瘤對放療的敏感性,但也有研究表明放療可以通過激活細胞的自噬性死亡殺傷腫瘤細胞,如Selvakumar Anbalagan等研究發(fā)現(xiàn)γ線放射可以在VHL基因缺陷的腎癌細胞中誘導自噬,而利用自噬誘導劑可以增強腎癌細胞對放療的敏感性。
  為了檢測γ線放射對FLCN基因缺陷腎腫瘤的治療效果,本實驗比較FLCN缺

28、失的腎癌細胞與其他類型腎癌細胞對γ線放射的敏感性差別,并檢測FLCN缺失或下調的腎癌細胞與對照組細胞在經(jīng)過γ線放射后凋亡及自噬水平上的差別。根據(jù)抑制或進一步激活自噬后細胞對γ線放射敏感性的變化,進一步確定自噬對FLCN基因缺失的腎癌細胞放療敏感性的影響。
  目的:
  1.檢測FLCN缺失的腎癌細胞對γ線放射的敏感性。
  2.在經(jīng)過γ線放射后,檢測FLCN缺失或下調的腎癌細胞與高表達FLCN的腎癌細胞在凋亡及自噬水

29、平上的差別。
  3.檢測自噬對FLCN基因缺失或下調的腎癌細胞放療敏感性的影響。
  4.檢測γ線放射在FLCN基因缺失或下調的腎癌細胞中誘導自噬的分子機制。
  材料和方法:
  1.細胞
  為確定FLCN對腎癌γ線放射敏感性的影響,本實驗使用ACHN,786-0,769-P,Caki-1和UOK257五種人腎癌細胞進行γ線放射后的克隆存活分析實驗。為檢測自噬對FLCN基因缺失或下調的腎癌細胞γ線放射

30、敏感性的影響,本實驗使用2組細胞:UOK257/UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc。其中UOK257是源自BHD綜合征患者的FLCN基因缺失的腎癌細胞系,UOK257-2是利用基因轉染技術建立的穩(wěn)定表達FLCN的細胞系;ACHN5968是利用siRNA技術將腎癌細胞系ACHN中FLCN表達下調的細胞系,ACHN-sc是在ACHN中轉入對照空白質粒的細胞。
  2.克隆存活分析實驗
  ACHN,786-0,7

31、69-P,Caki-1和UOK257細胞種于6cm細胞培養(yǎng)皿中,經(jīng)過0Gy、1Gy、3Gy和5Gy的γ線放射后,在正常細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14天,形成的細胞克隆經(jīng)0.5%的結晶紫染色后計數(shù)。為進一步檢測FLCN對腎癌細胞放療敏感性的影響,將2組細胞UOK257/UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc種于6cm細胞培養(yǎng)皿中,經(jīng)過0Gy、1Gy、3Gy、5Gy和7Gy的γ線放射后,再次進行細胞克隆的培養(yǎng)、染色和計數(shù)。根據(jù)實驗結果計

32、算各組細胞的細胞生存指數(shù)(Surviving fraction,SF):SF=平均細胞克隆數(shù)/初始細胞種植數(shù)×種植效率(plating efficiency,PE),PE=無放射對照組平均細胞克隆數(shù)/無放射對照組初始細胞種植數(shù)。
  3.γ線放射對細胞凋亡的影響
  細胞凋亡由TUNEL法測定:將UOK257/UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc單層細胞種于96孔板中,經(jīng)0Gy、3Gy和5Gy的γ線放射后,利用

33、TUNEL試劑盒測定凋亡細胞數(shù)量。提取放射后各組細胞總蛋白,利用western blot方法檢測cleaved caspase-3蛋白含量,進而間接比較實驗組和對照組細胞凋亡差別。
  4.γ線放射后細胞自噬的檢測
  細胞自噬通過MDC、GFP-LC3熒光分析以及LC3蛋白印跡分析三種方法檢測。MDC熒光分析:各組細胞種于6孔板中,經(jīng)0Gy、3Gy和5Gy的γ線放射后于正常培養(yǎng)條件下等待7小時,加入0.05mMMDC并在3

34、7℃條件下等待20分鐘,固定細胞后利用熒光顯微鏡觀察并計數(shù)細胞內熒光顆粒數(shù)量。GFP-LC3熒光分析:各組細胞轉染GFP-LC3質粒,24小時后細胞經(jīng)0Gy、3Gy和5Gy的γ線放射并于正常培養(yǎng)條件下等待7小時,利用熒光顯微鏡觀察并計數(shù)細胞內熒光顆粒數(shù)量。LC3蛋白印跡分析:各組細胞經(jīng)γ線放射后于正常培養(yǎng)條件下等待7小時,提取細胞總蛋白,經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉膜及抗體結合,觀察比較各組細胞內LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白含量。

35、>  5.檢測自噬對細胞γ線放射敏感性的影響
  利用自噬抑制劑或基因沉默技術抑制細胞自噬后,對各組細胞進行γ線放射,通過克隆存活分析實驗比較自噬抑制組和對照組細胞的生存指數(shù)曲線。為進一步證實自噬對細胞γ線放射敏感性的影響,本實驗使用自噬誘導劑雷帕霉素處理細胞,并觀察比較自噬誘導組和對照組細胞經(jīng)γ線放射后的生存指數(shù)曲線。
  6.自噬分子機制的檢測
  為探討γ線放射在FLCN缺失的腎癌細胞中誘導自噬的分子機制,本實驗

36、利用western blot檢測ERK信號通路的關鍵蛋白ERK/P-ERK,以及自噬調節(jié)蛋白Bceclin1,并利用基因沉默技術抑制細胞內Bceclin1蛋白表達后,再次檢測經(jīng)γ線放射后細胞自噬的變化。
  7.統(tǒng)計學分析
  本組實驗利用SPSS軟件包對各組實驗數(shù)據(jù)進行方差分析或t檢驗。所有數(shù)值用平均值±標準差表示。p<0.05表示具有顯著性差異。
  結果:
  1.FLCN降低腎癌細胞對γ線放射的敏感性AC

37、HN,786-0,769-P,Caki-1和UOK257五種人腎癌細胞中,ACHN細胞內FLCN蛋白含量最高,UOK257不表達FLCN蛋白??寺〈婊罘治鰧嶒灲Y果顯示,經(jīng)γ線放射后,ACHN細胞生存指數(shù)最高,UOK257細胞生存指數(shù)最低,表明FLCN可以降低腎癌細胞對γ線放射的敏感性。
  2.FLCN增加γ線放射后腎癌細胞的凋亡對UOK257/UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc兩組細胞進行γ線放射后,TUNEL實

38、驗結果顯示所有細胞中凋亡細胞數(shù)量均有所增加,而相較于FLCN缺失或下調的細胞(UOK257、ACHN5968),高表達FLCN的細胞(UOK257-2、ACHN-sc)凋亡更加明顯(p<0.05)。Westernblot結果顯示,經(jīng)γ線放射后,UOK257-2和ACHN-sc細胞內cleavedcaspase-3蛋白表達明顯高于UOK257和ACHN5968細胞,間接證明經(jīng)γ線放射后高表達FLCN的細胞凋亡更加明顯。
  3.FL

39、CN對γ線放射后腎癌細胞內自噬的影響對UOK257/UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc兩組細胞進行γ線放射后,MDC和GFP-LC3結果均顯示UOK257和ACHN5968細胞內熒光顆粒數(shù)量高于UOK257-2和ACHN-sc細胞,表明相較于高表達FLCN的細胞,γ線放射可以在FLCN缺失或下調的細胞中誘導更明顯的自噬。LC3-Ⅰ/Ⅱ的western blot結果顯示,與UOK257-2和ACHN-sc細胞相比,γ線放射

40、后UOK257和ACHN5968細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高,再次證明γ線放射在FLCN缺失或下調的細胞中誘導更明顯的自噬現(xiàn)像。
  4.檢測自噬對細胞γ線放射敏感性的影響利用自噬抑制劑3-MA處理細胞后,各組細胞在經(jīng)γ線放射后LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達無明顯變化,顯示自噬被成功抑制。當自噬被抑制后,UOK257和ACHN5968細胞對γ線放射的敏感性明顯降低,而UOK257-2和ACHN-sc細胞對γ

41、線放射的敏感性無明顯改變;利用基因沉默技術抑制beclin-1蛋白表達進而抑制細胞自噬后,可得到相似的實驗結果,顯示自噬可以升高FLCN缺失或下調的腎癌細胞對γ線放射的敏感性。本實驗利用自噬誘導劑雷帕霉素處理UOK257和ACHN5968細胞后,細胞內LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達明顯升高,且細胞對γ線放射的敏感性明顯升高,表明自噬誘導劑可以增強FLCN缺失或下調的腎癌細胞對γ線放射的敏感性。
  5.自噬分子機制的檢測Western b

42、lot結果表明,在腎癌細胞中,F(xiàn)LCN蛋白可以下調ERK信號通路關鍵蛋白P-ERK的表達。經(jīng)過γ線放射后,UOK257和ACHN5968細胞內P-ERK和Beclin1蛋白明顯升高,而利用基因沉默技術抑制Beclin1蛋白表達后,γ線放射未能在UOK257和ACHN5968細胞中誘導自噬,表明γ線放射通過激活ERK信號通路并上調Beclin1蛋白表達從而在FLCN缺失或下調的腎癌細胞中激活自噬反應。
  結論:
  1.FL

43、CN可以降低腎癌細胞對γ線放射的敏感性,無FLCN表達的UOK257腎癌細胞對γ線放射較敏感。
  2.相對于高表達FLCN的細胞,γ線放射可以在FLCN缺失或下調的腎癌細胞中誘導更明顯的自噬反應。
  3.自噬可以升高FLCN缺失或下調的腎癌細胞對γ線放射的敏感性,應用自噬誘導劑雷帕霉素可以增強γ線放射對UOK257和ACHN5968細胞的殺傷作用。
  4.γ線放射通過激活ERK信號通路并上調Beclin1蛋白表達

44、從而在FLCN缺失或下調的腎癌細胞中激活自噬反應。
  研究意義及創(chuàng)新性
  1.本實驗結果首次表明FLCN可以降低腎癌細胞對γ線放射的敏感性,且相對于高表達FLCN的細胞,γ線放射可以在FLCN缺失或下調的腎癌細胞中誘導更明顯的自噬反應。
  2.本實驗結果表明應用自噬誘導劑雷帕霉素可以增強γ線放射對FLCN缺失或下調的腎癌細胞的殺傷作用,并提出聯(lián)合應用自噬誘導劑和γ線放射可能會對BHD相關性腎癌具有較好的治療效果。

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