初始T淋巴細胞在腫瘤過繼性免疫治療中的應用研究.pdf

1、腫瘤性疾病嚴重威脅人類的生命健康，然而目前手術、化療、放療等臨床治療中所采用的傳統(tǒng)常規(guī)腫瘤治療方法均無法實現(xiàn)對體內(nèi)腫瘤細胞完全徹底的殺滅，使得惡性腫瘤不可避免的出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移，而且由于常規(guī)化療藥物及放療均無法實現(xiàn)針對腫瘤細胞的特異性殺傷，所以在治療殺傷腫瘤細胞的同時也使得正常組織細胞受到損傷，甚至影響機體免疫系統(tǒng)，存在較為嚴重的不良反應，使得實際臨床治療過程中部分腫瘤患者因不良反應嚴重無法耐受而被迫放棄治療，所以探尋新的腫瘤特異性的治療

2、手段成腫瘤治療領域的研究熱點。隨著生物科學的進步，為醫(yī)學基礎和臨床研究提供了新的思路和途徑，生物治療的概念逐漸引入到人類多種重大疾病的治療過程中。腫瘤生物免疫治療采用過繼性細胞回輸作為其主要治療方法是目前惡性腫瘤治療領域公認的新成就之一。是指在體外對免疫細胞進行激活、擴增，而后再將活化的免疫細胞重新回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi)，進行腫瘤殺傷的一種治療方法。目前在臨床中主要是提取患者外周血中的T細胞以及樹突狀細胞在體外條件下分別應用各種細胞因子進行

3、誘導刺激，活化成熟后共同培養(yǎng)，從而產(chǎn)生具有腫瘤特異性的細胞毒T淋巴細胞，而后再分次對經(jīng)過放療或化療預處理的患者進行過繼性回輸，在患者體內(nèi)產(chǎn)生具有靶向性的抗腫瘤細胞的細胞免疫殺傷療效。同時隨著相關研究的逐步增多，如何實現(xiàn)T細胞高效、快速的體外篩選、擴增，如何使T細胞能夠高度特異性地靶向識別腫瘤靶點，如何使T細胞在體內(nèi)存活時間盡可能延長以及如何能夠有效調(diào)控T細胞在體內(nèi)的增殖情況等均成為這一領域的研究熱點。同時由于腫瘤微環(huán)境中存在復雜的免疫抑

4、制網(wǎng)絡，是困擾腫瘤免疫治療的關鍵，使得腫瘤免疫治療的實際效果受到了限制，總體療效并不令人滿意。早在1979年Lord等人就正式提出了腫瘤微環(huán)境的概念，腫瘤微環(huán)境即指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中所處的宿主機體的內(nèi)在環(huán)境，由腫瘤細胞自身、間質(zhì)細胞、微血管、微淋巴管、局部浸潤性細胞、各種細胞因子以及組織液等共同構成。存在于腫瘤微環(huán)境中的各種免疫抑制性細胞及抑制性細胞因子造就了腫瘤病變局部的免疫抑制性微環(huán)境，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲等方面發(fā)揮著重要

5、作用。所以通過特定手段對腫瘤患者體內(nèi)腫瘤微環(huán)境進行干預可以提高過繼性免疫治療的療效，應用全身化療干擾腫瘤微環(huán)境是目前臨床上最常用的方法之一。
　　T細胞包括初始T細胞(naive T細胞)和記憶性T細胞(memoryT細胞)兩個重要功能亞群。初始T細胞(naive T cells)是指脫離胸腺組織后還未受到過抗原刺激的T細胞，是T細胞的重要功能亞群，對于機體針對新抗原產(chǎn)生免疫應答非常重要，在機體內(nèi)通過在血液與次級淋巴器官間的再循環(huán)

6、執(zhí)行著免疫監(jiān)視功能，受到抗原刺激的時候，樹突狀細胞(DC)攝取抗原物質(zhì)加工后在淋巴結中遞呈給初始T細胞，初始T細胞能發(fā)生活化及增殖，分化成為具有靶向殺傷能力的效應性T細胞來發(fā)揮作用，當初始T細胞經(jīng)細胞分化成為效應性T細胞后，其功能以及游走性質(zhì)均發(fā)生變化，且活化的效應性T細胞具有極強的增殖活性，幾天內(nèi)可以擴增達1000倍以上。隨著研究的不斷深入，其在過繼性免疫治療中的應用價值逐漸得到了人們的重視。所以本研究設計了第一部分實驗，應用B16腫

7、瘤細胞接種于C57BL/6小鼠造模，通過流式細胞分析技術檢測不同荷瘤時長的小鼠外周血初始T淋巴細胞數(shù)量水平的動態(tài)變化情況，了解初始T細胞水平與小鼠荷瘤后機體免疫狀態(tài)的關系，為制定個體化免疫治療方案完善相關數(shù)據(jù)。并進一步設計第二部分體外實驗，應用磁珠陰性分選的方法分離提取C57BL/6小鼠脾細胞懸液中的初始T細胞及總T細胞，在體外條件下了解初始T細胞的功能特性。最終在應用環(huán)磷酰胺干擾小鼠腫瘤微環(huán)境的基礎上進行第三部分實驗，對荷瘤的C57B

8、L/6小鼠分別給予初始T細胞來源的效應細胞(TEFFN)及總T細胞來源的效應細胞(TEFFP)回輸治療，進一步對比觀察在復雜的體內(nèi)環(huán)境中初始T細胞來源的效應細胞的療效。
　　第一部分、不同荷瘤時長的小鼠外周血初始T淋巴細胞水平變化情況的研究
　　目的:通過流式細胞分析技術檢測不同荷瘤時長的小鼠外周血初始T淋巴細胞數(shù)量水平的動態(tài)變化情況，了解初始T細胞水平與小鼠荷瘤后機體免疫狀態(tài)的關系，為制定個體化免疫治療方案完善相關數(shù)據(jù)。<

9、br>　　方法:應用C57BL/6小鼠通過背部皮下接種B16腫瘤細胞株制備惡性黑色素瘤的小鼠荷瘤模型;造模成功后定期處死小鼠取脾制備脾淋巴細胞懸液，應用流式細胞分析技術檢測其中初始T淋巴細胞的數(shù)量水平，并設定正常不荷瘤小鼠為空白對照組。
　　結果:
　　1.將B16黑色素瘤細胞株接種于C57BL/6小鼠背部皮下，10天后局部可見直徑約2-3mm的腫瘤略突出于皮面，顏色呈黑色，提示小鼠荷瘤模型成功建立。
　　2.荷瘤組及

10、對照組小鼠隨周齡的增加及荷瘤時間的延長其外周血中初始T細胞水平均會出現(xiàn)下降表現(xiàn)，但荷瘤組下降幅度更為顯著(P＜0.05)。
　　結論:隨著小鼠荷瘤時間延長荷瘤負擔的增加，其外周血初始T細胞含量出現(xiàn)進行性下降，提示初始T細胞水平與小鼠荷瘤后機體免疫狀態(tài)有著密切的關系。
　　第二部分、初始T細胞的分離提取及體外功能檢測
　　目的:了解初始T細胞在體外環(huán)境中的功能特性。
　　方法:應用磁珠陰性分選方法由小鼠脾淋巴細胞懸

11、液中分選得出總T細胞，并流式細胞學檢測了解總T細胞中初始CD8+T細胞及初始CD4+T細胞的比例，由小鼠脾淋巴細胞懸液中分選得出初始CD8+T細胞和初始CD4+T細胞依照比例混合得到初始T細胞，檢測對比體外條件下，初始T細胞及總T細胞的增殖活性、細胞因子分泌能力以及不同細胞來源的效應細胞對B16細胞的殺傷能力。
　　結果:
　　1.經(jīng)磁珠陰性分選得到富集的CD3+T、初始CD8+T及初始CD4+T細胞，流式檢測鑒定其純度，分

12、選后CD3+T細胞純度達90.4±1.3％、分選后初始CD8+T細胞純度達88.6±0.5％、分選后初始CD4+T細胞純度達82.2±0.9％，細胞純度能夠滿足實施進一步實驗的需要。
　　2.經(jīng)流式細胞學檢測總CD3+T細胞中初始CD4+T細胞與初始CD8+T細胞比值為（1.9±0.1）∶1，故選擇初始CD4+T細胞∶初始CD8+T細胞=2∶1的比例進行混合培養(yǎng)，將混合培養(yǎng)的初始T細胞用于后續(xù)實驗。
　　3.分別對總T細胞組

13、及初始T細胞組給予兩次刺激，應用CCK-8染色、酶標儀測定各實驗孔OD值提示經(jīng)第一次刺激后總T細胞及初始T細胞均較刺激前有增殖，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但總T細胞與初始T細胞增殖水平間無明顯差異(P＞0.05);而在給予第二次刺激后與第一次刺激后比較，總T細胞增殖無明顯差異(P＞0.05)，初始T細胞出現(xiàn)明顯增殖，差異顯著具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），經(jīng)第二次刺激后初始T細胞增殖水平較總T細胞者增高(P＜0.05)4.將腫瘤細

14、胞與CTL共培養(yǎng)后初期可見到CTL細胞聚集于B16細胞表面，隨時間延長后可見到B16腫瘤細胞縮小、細胞皺縮變形、破碎裂解壞死。結果示殺傷反應后TEFFP+B16組及TEEFN+B16組B16細胞數(shù)量較單一B16組均減少(P＜0.05)，同時TEFFN+B16組B16細胞數(shù)量少于TEFFP+B16組(P＜0.05)。5.經(jīng)酶標儀檢測各不同反應階段上清液中IL-2及IFN-r水平，在T細胞與TL-DC首次接觸活化CTL后上清液中IL-2及I

15、FN-r水平總T細胞組均較初始T細胞組增高(P＜0.05)，而在體外殺傷實驗中所得上清液中IL-2及IFN-r水平，總T細胞組較殺傷反應前降低(P＜0.05)，而初始T細胞組較殺傷反應前升高，且明顯高于總T細胞組(＜0.05)。
　　結論:在體外條件下初始T細胞較總T細胞有著更強的增殖能力、細胞因子釋放能力及效應細胞有更強的殺傷能力。
　　第三部分、初始T細胞來源的CTL回輸治療效果觀察
　　目的:了解初始T細胞來源的

16、效應細胞在體內(nèi)環(huán)境中的功能特性。
　　方法:依照第二部分實驗方法分選T細胞，得到總T細胞及初始T細胞;應用C57BL/6小鼠通過背部皮下接種B16腫瘤細胞株制備惡性黑色素瘤的小鼠荷瘤模型;應用環(huán)磷酰胺腹腔注射干擾荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境;于環(huán)磷酰胺預處理后第4天，將分別1×106的TEFFP或TEFFN，經(jīng)鼠尾靜脈注射回輸入成功荷瘤的小鼠體內(nèi)進行過繼性免疫治療，并設對照組給予回輸?shù)润w積PBS，于回輸后72小時處死部分小鼠取腫瘤組織，CF

17、SE標記的效應細胞組應用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強度，無熒光標記組腫瘤標本應用熒光定量PCR技術檢測腫瘤組織內(nèi)Perfoin mRNA、granzymemRNA、IL-2 mRNA及IFN-rmRNA表達水平，剩余小鼠用于觀察對比不同來源DC-CTL過繼治療對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響，每2天測量腫瘤體積繪制荷瘤變化曲線。
　　結果:
　　1.腹腔注射CTX可以有效降低荷瘤小鼠外周血CD4+ CD25+ Foxp3+T細胞水平(

18、P＜0.05)、血清TGF-β水平(P＜0.05)以及血清IL-10水平（P＜0.05），其腹腔注射CTX對于腫瘤生長未見明顯影響。
　　2.CFSE染色的DC-CTL細胞回輸小鼠腫瘤組織制冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察檢測熒光強度提示，在腫瘤組織中均可檢測到熒光染色細胞的存在，且TEFFN組較TEFFP組熒光強度高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　3.經(jīng)熒光定量PCR檢測腫瘤組織內(nèi)Perfoin mRNA、granzy

19、me mRNA、IL-2 mRNA及IFN-rmRNA表達情況，TEFFN組各指標表達情況均高于TEFFP組，均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。4.不同細胞來源的成熟DC-CTL過繼治療對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響觀察顯示，空白對照組小鼠腫瘤增長明顯，給予DC-CTL治療后，小鼠腫瘤生長速度較對照組顯著下降，有統(tǒng)計學差異，而TEFFN組小鼠腫瘤生長速度較TEFFP組為低，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)結論:初始T細胞來源的效應細胞可以表現(xiàn)出更