miR-210抑制食管Eca109細胞生長的機制研究.pdf

1、我國食管癌發(fā)病和死亡人數(shù)約占全球的二分之一。放射治療是目前食管癌主要的治療手段之一，但是5年生存率僅有10％～30％。研究表明，腫瘤乏氧細胞的產(chǎn)生和存在使腫瘤對放療的抗拒性增加，是影響腫瘤放射治療療效的主要原因之一。
　　乏氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)是介導腫瘤細胞的乏氧適應性變化的關鍵調(diào)控因子。近年來的研究表明，miR-210作為HIF-1α新發(fā)現(xiàn)的下游靶基因，參與了多種

2、細胞生物學功能的調(diào)控，如:能量代謝、細胞周期、DNA損傷修復等。已有研究證實，miR-210過表達可引起腫瘤細胞G1/S期和/或G2/M期阻滯，干擾有絲分裂進程，抑制腫瘤生長。其中G1/S期阻滯與miR-210特異性抑制E2F轉錄因子3(E2Ftranscription factor3，E2F3)和成纖維細胞生長因子受體樣因子1（Fibroblast Growth Factor Receptor-like1，F(xiàn)GFRL1）的表達有關。然

3、而目前關于miR-210誘導G2/M期阻滯所涉及的靶基因還鮮有報道，具體調(diào)控機制也尚不明了。有研究稱原癌基因(c-MYC)的競爭性抑制劑Max結合蛋白(Max's next tango，MNT)也是miR-210的靶基因，在乏氧條件下，miR-210可以通過抑制它的表達加速細胞周期進程。因此，miR-210調(diào)控細胞周期的機制及其對細胞增殖的具體影響都還有待進一步揭示。
　　循環(huán)miRNA具有單鏈小分子特性，多以RNA/蛋白復合體的

4、形式存在，穩(wěn)定性比其他核酸分子高，RNA酶不易降解，適合作為分子標志物。此前有3項研究分別報道了循環(huán)miR-210在胰腺、乳腺、腎臟腫瘤中高表達。盡管上述研究的樣本量較小，但結果的一致性表明循環(huán)miR-210的差異性表達或可為腫瘤診斷提供幫助。目前還未見食管癌患者循環(huán)miR-210表達情況的報道，而且此前的研究多關注于手術對腫瘤患者循環(huán)miRNA表達的影響，對于根治性放療前后循環(huán)miRNA表達的變化還鮮有報道。
　　本研究首先觀察

5、并檢測了人食管鱗癌Eca109細胞在乏氧條件下miR-210的表達情況，通過轉染miR-210 mimics觀察miR-210過表達對Eca109細胞增殪、周期、凋亡的影響，并探討其可能的作用機制;其次，應用生物信息技術篩選出miR-210調(diào)控G2/M期轉換的可能靶基因Plk1，通過構建熒光素酶報告質(zhì)粒pmiR-RB-REPORTTM-Plk1，檢驗Plk1基因mRNA的3'UTR區(qū)域是否包含miR-210的作用結合位點，并檢測過表達m

6、iR-210對Plk1蛋白表達水平的影響，驗證Plk1是否是miR-210的直接靶基因;最后，通過檢測食管癌患者及健康志愿者血漿miR-210的表達水平，并對比食管癌患者根治性放療前后血漿miR-210的表達變化，了解血漿miR-210對食管癌的診斷及放療療效評估價值。
　　第一部分 miR-210在乏氧食管Eca109細胞中的表達及其對細胞生物學行為的影響
　　目的:檢測miR-210在乏氧食管Eca109細胞中的表達水平

7、，并探討其對細胞增殖、周期、凋亡的影響。
　　方法:RT-PCR檢測不同乏氧時相食管鱗癌Eca109細胞中miR-210的表達。采用CCK-8增殖實驗、EdU增殖實驗、流式細胞儀檢測miR-210過表達對Eca109細胞增殖、周期、凋亡的影響
　　結果:經(jīng)RT-PCR檢測，Eca109細胞乏氧培養(yǎng)12h后miR-210的表達就有明顯增高，24h后達峰值，較常氧組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。CCK-8及EdU細胞增殖實

8、驗顯示，miR-210 mimics轉染24、48h后Eca109/miR-210組增殖細胞活力比例均較Eca109/Control組和Eca109/ncRNA組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。流式細胞分析顯示，轉染24h后，同Eca109/Control和Eca109/ncRNA相比，Eca109/miR-210組出G2/M期細胞比例明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);轉染48h后，Eca109/miR-210組

9、G2/M期增多更為明顯(P＜0.01)。然而，Eca109/miR-210、Eca109/Control和Eca109/ncRNA三組轉染24、48h后細胞凋亡比例未見明顯變化。
　　結論:miR-210在乏氧食管Eca109細胞中高表達，miR-210過表達抑制細胞增殖，其機制可能與G2/M期阻滯相關。
　　第二部分 miR-210靶向調(diào)控Plk1基因表達的研究
　　目的:篩選miR-210調(diào)控G2/M期轉換的可能靶

10、基因，并驗證miR-210對預測靶基因的調(diào)控關系。
　　方法:應用生物信息學手段對miR-210的可能靶基因進行預測，經(jīng)酶切及基因測序鑒定構建含有預測靶基因3'-UTR報告載體pmiR-RB-REPORTTM，應用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測細胞內(nèi)熒光活性的變化。WesternBlot檢測miR-210對預測靶基因蛋白表達的影響。
　　結果:通過生物信息學預測，篩選Plk1作為miR-210調(diào)控G2/M期轉換的潛在靶基因。經(jīng)過酶切及

11、基因測序鑒定，成功構建含有Plk1基因3'-UTR熒光素酶報告載體pmiR-RB-REPORTTM-Plk1。與共轉染pmiR-RB-Report_PLK1+mimic sNC相比，HEK293T/17細胞共轉染pmiR-RB-Report_PLK1+mimics210后熒光素酶活性顯著下(P＜0.01)。轉染miR-210 mimics48h后，對Eca109細胞進行Plk1蛋白的檢測，結果提示與Eca109/Control組及Eca

12、109/NC組比較，Eca109/miR-210組Plk1蛋白表達水平顯著下降(P＜0.01)。
　　結論:miR-210與靶基因Plk1 mRNA3'-UTR能夠有效結合，miR-210過表達抑制Plk1基因蛋白表達。Plk1是miR-210的直接靶基因。
　　第三部分放療對食管鱗癌患者血漿miR-210、miR-21表達水平的影響
　　目的:檢測食管癌患者血漿miR-210、miR-21表達水平，并評估根治性放療對

13、血漿miR-210、miR-21表達水平的影響。
　　方法:采集食管癌初治患者根治性放療前后及健康志愿者血液標本，應用TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR法檢測血漿miR-210和miR-21的表達水平。
　　結果:22例初治食管鱗癌患者及15例健康志愿者入組，共采集合格血液樣本59份。RT-PCR顯示，食管癌組血漿miR-210、miR-21的表達較健康對照組明顯升高(P＜0.01)。血漿miR-210、miR-21表