Endostatin基因轉(zhuǎn)導人臍帶血CD34+造血干細胞的實驗研究.pdf

1、目的:將人血管內(nèi)皮抑制素Endostatin轉(zhuǎn)導人臍帶血CD34+造血干細胞厲分析其表達和分泌情況.方法:利用逆轉(zhuǎn)錄病毒plncx做載體,將plncx-endostatin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌,用氨芐青霉素(AMP)進行篩選,小劑量培養(yǎng)擴增,用堿裂解法回收后,用HindⅢ和ClaⅠ雙酶切鑒定.用電擊穿孔法(electroporation)將重組質(zhì)粒plncx-Endostatin轉(zhuǎn)導包裝細胞PA317,用G418進行篩選獲得轉(zhuǎn)

2、導成功的PA317細胞并進行培養(yǎng),提取病毒上清并劇NIH3T3檢測濃度.取新鮮人臍帶血40~80ml用Ficoll分離出單個核細胞,再用免疫磁珠(MiniMACS)進一步分離出CD34+造血干細胞.將病毒上清與人臍帶血CD34+造血干細胞共培養(yǎng)72小時.應(yīng)用PCR及Westernbolt檢測人Endostatin在臍帶血造血干細胞中的轉(zhuǎn)導、表達和分泌.結(jié)果:plncx-endo質(zhì)粒在DH5 a大腸桿菌中克隆擴增后,經(jīng)酶切鑒定有endos

3、tatin基因存在.流式細胞儀(FCM)檢測,CD34+干細胞在臍血中的初始含量<5％,經(jīng)Mini-MACS分離純化,純度超過90％.從1×10<'8>的界面細胞,平均可以分離獲得(5~20)×10<'5>CD34+干細胞.電穿孔介導重組基因轉(zhuǎn)導人臍帶血CD34+造血干細胞后,經(jīng)PCR證實,轉(zhuǎn)導Endostatin基因的人臍帶血CD34+造血干細胞基因組中存在有550bp Endostatin人特異性片段,Westernbolt分析示人

4、Endostatin在轉(zhuǎn)導細胞中獲得穩(wěn)定表達和分泌.結(jié)論:1.電穿孔可有效地介導重組基因的轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)導效率高,安全無副作用,操作簡單.2.PA317細胞能有效地為逆轉(zhuǎn)錄病毒提供包裝蛋白,使之成為完整的病毒顆粒,并能用G418對轉(zhuǎn)導的包裝細胞進行篩選.3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度達10<'6>以上,能有效感染靶細胞.4.經(jīng)病毒上清感染后,CD34+/endo細胞能高表達endostatin基因,合成endostatin蛋白.輸入CD34+/end