T細胞免疫功能及線粒體凋亡途徑變化在多次妊娠TA2小鼠自發(fā)性乳腺癌中的作用.pdf

1、目的：
　　 1.通過觀察TA2小鼠不同次數(shù)妊娠期間及分娩后不同時間脾細胞中T淋巴細胞亞群以及IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ四種細胞因子的變化規(guī)律，揭示妊娠及分娩與TA2小鼠T細胞免疫功能的關(guān)系。通過比較經(jīng)產(chǎn)、未產(chǎn)及自發(fā)瘤組TA2小鼠機體T細胞免疫狀況，初步探討T細胞免疫功能與TA2小鼠自發(fā)性乳腺癌的發(fā)生機制。
　　 2.通過將TA2小鼠不同次數(shù)妊娠期間及分娩后不同時間T細胞免疫狀況與其機體雌二醇（E2）、孕

2、酮（P）分泌水平進行相關(guān)性分析，初步揭示E2、P與T細胞免疫功能的關(guān)系，并采用外源性注射雌激素與孕激素的實驗驗證其間關(guān)系。
　　 3.通過觀察TA2小鼠不同次數(shù)妊娠期間及分娩后不同時間乳腺上皮細胞增殖指數(shù)以及凋亡指數(shù)的變化，初步推斷TA2小鼠發(fā)瘤前乳腺上皮細胞的狀態(tài)；同時，通過檢測線粒體凋亡通路中，Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達，以及乳腺上皮細胞中雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）的表達，

3、對比發(fā)瘤前及發(fā)瘤后的狀態(tài)，探討TA2小鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生的可能機制。
　　 方法：
　　 1.收集TA2小鼠不同次數(shù)妊娠期間及分娩后不同時間以及自發(fā)瘤小鼠脾細胞和血清，采用流式細胞術(shù)檢測脾細胞CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群，計算CD4+/CD8+T細胞比值。利用ELISA方法檢測血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ四種細胞因子水平，并計算Th1/Th2。
　　 2.采用相關(guān)性分析，分析E2

4、、P與CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群以及IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ四種細胞因子之間的相關(guān)性。
　　 3.對成年TA2雌鼠行卵巢切除術(shù)（OVX），外源性給與雌激素、孕激素干預，觀察E2和/或P對OVX小鼠T細胞免疫功能的影響。
　　 4.收集TA2小鼠不同次數(shù)妊娠期間及分娩后不同時間以及自發(fā)瘤小鼠乳腺組織，采用免疫組化方法檢測乳腺上皮細胞中PCNA的表達，計算增殖指數(shù)；采用TUNEL方法檢測乳腺

5、上皮細胞中的細胞凋亡，計算凋亡指數(shù)；采用免疫組化、Real-time PCR和Western blotting方法檢測組織中ER、PR.、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達及mRNA相對表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.妊娠及分娩對TA2小鼠T細胞免疫功能的影響
　　 （1）對T淋巴細胞亞群的影響：TA2小鼠妊娠及分娩后不同時間內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+差

6、別具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　 （2）對細胞因子的影響：TA2小鼠妊娠及分娩后不同時間內(nèi)IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和Th1/Th2差別具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 2.雌激素與孕激素對TA2小鼠T細胞免疫功能的影響
　　 （1）妊娠及分娩對TA2小鼠E2和P的影響：TA2小鼠妊娠及分娩后不同時間內(nèi)E2和P差別均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　 （2）相關(guān)性分析結(jié)果

7、顯示：E2、P與CD8+T和IL-10呈正相關(guān)（P<0.01），而E2與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2、IL-4、IFN-γ呈負相關(guān)（P<0.05）；P與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2呈負相關(guān)（P<0.01）。
　　 （3）外源性給與雌激素、孕激素干預結(jié)果顯示：與對照組比較，E2+P聯(lián)合作用組各指標均與對照有差別，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　 3.妊娠及分娩對TA2小鼠乳腺

8、上皮細胞增殖和凋亡的影響TA2小鼠妊娠及分娩后不同時間內(nèi)增殖指數(shù)（PI）和凋亡指數(shù)（AI）差別均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。隨著妊娠天數(shù)的增加，AI逐漸增加，以P20最為明顯（47.23±15.89，P<0.01）。分娩后，AI并未立即下降，在PP1和PP7仍然持續(xù)較高水平，PP21以后逐漸下降。AI在妊娠期間較低，分娩后有所升高，以PP1最高（59.48±11.37，P<0.01），隨后有所下降。多次妊娠間，以4P20 PI和AI

9、最高（86.20±7.09，74.80±10.99），且明顯高于1P、2P（P<0.01）。
　　 4.ERa和PR在TA2小鼠乳腺上皮細胞中的表達（1）免疫組化染色結(jié)果顯示：妊娠和分娩不同階段乳腺上皮細胞ERa和PR表達差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。妊娠后乳腺上皮細胞中ERa和PR表達明顯高于未妊娠小鼠，到妊娠20天達到最大（ERα：84.60±9.40，PR：2.52±0.81，P<0.01）。分娩后表達水平逐漸下降，

10、到第42天，基本與未妊娠小鼠相近。多次妊娠間，4P小鼠各時段ERa和PR表達明顯高于1P、2P（P<0.01或P<0.05）。
　　 （2）Real-time PCR結(jié)果顯示：不同妊娠次數(shù)TA2小鼠ERα mRNA和PR mRNA表達之間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.05），且4P小鼠各時段ERα mRNA和PR mRNA表達均不同程度明顯高于1P～3P（P<0.01或P<0.05）。
　　 5.Bcl-2、

11、Bax、Caspase-3和Caspase-9在不同妊娠次數(shù)TA2小鼠乳腺上皮細胞中的表達
　　 （1）免疫組化染色結(jié)果顯示：正常TA2小鼠乳腺上皮細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9均呈低表達。妊娠期時均有所升高，其中以妊娠20天時最為明顯（P<0.01或P<0.05）；在分娩后，Bcl-2、Bax、Caspase-3繼續(xù)升高，到了分娩后21天，達到最大值（Bcl-2:8.04±0.83；Bax：9

12、.92±0.77；Caspase-3：9.60±0.40，P=0.000），Caspase-9變化不大。到分娩后42天基本恢復至正常。不同妊娠次數(shù)TA2小鼠Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9表達之間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。4P小鼠各時段Bcl-2和Bax表達明顯高于1P～3P（P<0.01），Caspase-3和Caspase-9表達明顯高于1P、2P（P<0.01或P<0.05）。
　　 （

13、2）Real-time PCR結(jié)果顯示：不同妊娠次數(shù)TA2小鼠四個基因表達差異具有統(tǒng)計學意義（P>0.01或P<0.05）。其中，4P小鼠各時段bcl-2，bax，caspase-3和caspase-9 mRNA表達明顯高于1P～3P（P<0.01或P<0.05）。
　　 （3）Western blotting結(jié)果顯示：基本與免疫組化結(jié)果一致。3P、4P小鼠各時段Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9表達明顯

14、高于1P、2P（P<0.01或P<0.05），其中以妊娠20天最為顯著。
　　 6.ER、PR、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9在正常乳腺、癌前乳腺及乳腺癌組織中的表達
　　 免疫組化染色，Real-time PCR以及Western blotting結(jié)果-致顯示：與8MV比較，除PR低于8MV（P<0.01）外，SBC小鼠乳腺ERα，Bcl-2，Bax，Caspase-3和Caspase-9表

15、達均明顯高于8MV（P<0.01或P<0.05）；自發(fā)瘤組織中ERα，PR，Bcl-2，Bax，Caspase-3和Caspase-9蛋白表達均明顯低于8MV（P<0.01），但bcl-2，bax和caspase-3 mRNA表達均顯著高于正常8MV小鼠（P<0.01），caspase-9mRNA略高于8MV，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。ERα和PR mRNA在腫瘤組織中表達均低于正常8MV小鼠（P〈0.01），其中PR更為明顯（P