墨汁灌注和血管鑄型方法在組織工程骨血管化檢測中的應用.pdf

1、組織工程是一門融會通材料科學、生物技術(shù)和生命科學的最新進展而誕生的新興交叉學科。骨組織工程則是應用組織工程技術(shù)來構(gòu)建組織工程骨用于臨床治療骨缺損。臨床上常見因創(chuàng)傷或骨病所致骨缺損，一般需要植骨治療，現(xiàn)有常用的臨床修復骨缺損方法有很多，如自體骨、庫存同種異體骨、經(jīng)特殊處理的異種骨移植、人工骨材料等，在臨床上各有其優(yōu)缺點，且效果存在較大差異。理論上，采用組織工程的方法用自體細胞和支架材料培養(yǎng)成復合體來修復骨缺損成為一種最為有效的方法。但在實

2、際臨床應用中還有許多問題尚未解決，其中血管化是組織工程骨成活的關鍵，目前組織工程骨血管化的方法有許多，如筋膜包裹、血管束植入、血管生長因子復合等，這些方法血管化是否成功、血管化的效果尚不確定，血管化后的組織工程骨血管供血及分布的檢測還沒有有效的方法。現(xiàn)在常用的檢測血管的方法很多，如B超、數(shù)字減影血管造影(DSA)、放射性核素顯像(BCT)及CT、MRI等，這些方法都能根據(jù)血流灌注的程度等從某些方面反映血管的生長及分布。但都存在某些方面的

3、不足，而且不能提供確切的直接證據(jù)。 墨汁灌注是一種目前常用的血管檢測方法。從需要觀察的組織器官的主要供血血管插管，將血管沖洗干凈后灌入配好的復合墨汁，制作切片或者磨片后在光鏡下觀察。該方法可清楚的顯示微動脈、微靜脈及毛細血管，制作較厚的切片或磨片時，血管的連續(xù)性好，借助目鏡測微尺或圖像分析，可以較準確測量毛細血管內(nèi)徑及密度，是觀察微血管比較理想的方法。該方法簡單、方便、經(jīng)濟、檢測血管準確、直觀，在骨組織工程動物實驗血管化檢測中已

4、有廣泛的應用，并取得了較好的效果。 血管鑄型標本的制作是一項目前很成熟、應用已經(jīng)十分廣泛的解剖學技術(shù)，屬于管道鑄型技術(shù)的一種，為研究某器官或組織的血管分布，往管腔注入某種填充物質(zhì)，待硬化后，將組織腐蝕清除，僅留下填充物的方法。以往只能顯示較大的血管，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，特別是填充劑的改進，血管鑄型技術(shù)日趨完善，選擇合適的填充劑，調(diào)節(jié)填充劑的濃度及灌注壓力等因素，就可以根據(jù)需要顯示不同管徑大小的血管，借助掃描電鏡觀察現(xiàn)在已能顯示極其

5、微小的毛細血管前微動脈和后微動脈。目前應用已十分廣泛，在許多組織器官血管檢測中均有應用，在骨組織血管的顯示中也有許多報道，但是在骨組織工程動物實驗中的應用尚未見報道。 研究目的 1、通過對正常山羊脛骨血管的檢測，尋求兩種比較合適的血管墨汁灌注和血管鑄型方法，并比較其在山羊脛骨血管檢測中的優(yōu)缺點，以指導骨組織工程血管化檢測方法的選擇，為組織工程骨血管化檢測尋找一種準確、直觀、可行的方法。 2、經(jīng)過在第一部分實驗的探

6、索后，選用一種較為準確、直觀的方法，觀察用組織工程方法修復中國青山羊單側(cè)左后肢脛骨中段20mm骨與骨膜缺損三年后的遠期血管化情況。 實驗方法 1、12只正常中國青山羊隨機分為墨汁灌注組，甲基丙烯酸甲酯鑄型灌注組，每組6只。墨汁灌注組采用中華墨汁、甲醛及生理鹽水體積比3∶1∶6的復合墨汁，行雙側(cè)股動脈插管，經(jīng)血管沖洗后進行灌注，低溫放置24小時后取下脛骨標本行進一步處理，甲基丙烯酸甲酯血管鑄型組，每只山羊均行雙側(cè)后肢股動脈

7、插管，血管徹底沖洗后將預聚后的甲基丙烯酸甲酯灌注，低溫放置24h～48h后取下脛骨標本行下一步處理。灌注后每組分別采用大體解剖，未脫鈣骨磨片和脫鈣后組織切片等方法觀察中國青山羊脛骨血管的走行與分布，比較兩種方法的優(yōu)缺點。 2、用組織工程方法修復了左后肢脛骨中段20mm骨與骨膜缺損3年后的中國青山羊3只，每只山羊均行雙側(cè)后肢x線攝片，測骨缺損處光密度與周圍軟組織光密度的比值，與健側(cè)相同部位正常骨比較，進行配對樣本t檢驗。行雙側(cè)后肢

8、股動脈鑄型灌注，灌注后每組分別采用大體解剖，未脫鈣骨磨片和脫鈣后組織切片以及掃描電鏡等方法觀察檢測組織工程骨血管化的效果及程度。取組織工程骨近端、遠端及中間三處的橫切面磨片做圖像分析，計算組織工程骨與健側(cè)相同部位正常骨的血管相對面積，求每組均數(shù)±標準差，進行配對樣本t檢驗。 結(jié)果 1、正常山羊脛骨經(jīng)本實驗中采用的墨汁灌注方法灌注后通過大體解剖、未脫鈣骨磨片和脫鈣骨組織切片可清楚顯示骨膜、骨皮質(zhì)、和髓腔血管，同時可以觀察骨

9、組織的顯微結(jié)構(gòu)，但不便于直觀地觀察脛骨與周圍血管的空間立體結(jié)構(gòu)；本實驗中采用的甲基丙烯酸甲酯血管鑄型方法對山羊脛骨進行灌注后制作的大體解剖標本，在脛骨中段制作2cm×1cm骨窗，可見髓腔內(nèi)的鑄型血管，骨皮質(zhì)橫、縱切面上可見微細的鑄型血管斷面；可以直觀地觀察山羊脛骨與周圍血管的空間立體構(gòu)筑，顯示脛骨營養(yǎng)血管的分布、走行，未脫鈣骨磨片能夠清楚的顯示骨皮質(zhì)血管網(wǎng)，掃描電鏡可以觀察到哈佛氏管內(nèi)的血管。 2、組織工程修復山羊脛骨缺損3年后

10、，X線攝片骨光密度測定，與健側(cè)正常骨比較無顯著性差異(P＞0.05)；血管灌注后大體解剖觀察示組織工程骨血管來源周圍軟組織、髓腔及兩端正常骨；血管鑄型灌注后未脫鈣骨磨片顯示組織工程骨內(nèi)微血管沿哈佛氏管和伏克曼管分布交織成網(wǎng)狀，橫切面磨片采用圖像分析儀分析與正常骨血管相對面積比較無顯著差異(P＞0.05)。脫鈣后的組織切片HE、硫堇染色示組織工程骨具有與正常骨一致的顯微結(jié)構(gòu)。 結(jié)論 1、本實驗采用的墨汁灌注和血管鑄型兩種方

11、法都是比較準確、直觀的血管檢測方法。血管墨汁灌注適合用于微血管檢測，便于染色后同時觀察骨組織顯微結(jié)構(gòu)，而血管鑄型標本則適合大體觀察血管的空間立體構(gòu)筑，較為直觀，兩種方法在骨組織工程血管化檢測中有不同的應用價值。 2、組織工程修復山羊脛骨缺損三年后經(jīng)甲基丙烯酸甲酯血管鑄型灌注方法進行血管檢測觀察結(jié)果表明，組織工程骨具有良好的修復山羊脛骨大段骨缺損能力，其顯微結(jié)構(gòu)及血管化程度達到了正常生理骨水平，為骨組織工程下一步臨床應用提供了可靠