雙基因修飾促進(jìn)組織工程化人工骨血管化的研究.pdf

1、大段骨缺損的修復(fù)是臨床面臨的一大難題，目前尚未得到很好地解決。近年來組織工程的發(fā)展有望成為治療大段骨缺損的新方法，但組織工程化的人工骨用于大段骨缺損的治療時(shí)有一個(gè)關(guān)鍵性的問題必需克服，即人工骨血管化的問題。因?yàn)槭欠裱芑瘺Q定了植入體內(nèi)的人工骨能否成活。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血管生成素（Ang-1）是兩個(gè)在血管形成及塑型過程中起重要作用的兩個(gè)細(xì)胞因子，本研究使用重組腺病毒將這兩個(gè)具有高效促血管形成能力的細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入骨髓基質(zhì)

2、干細(xì)胞（MSCs），基因轉(zhuǎn)染后的MSCs作為種子細(xì)胞與I型膠原改性的PLGA-TCP材料復(fù)合，構(gòu)建新型的雙基因修飾的組織工程化人工骨，以期在采用組織工程化人工骨治療大段骨缺損時(shí)能促進(jìn)人工骨的血管化，進(jìn)而有效修復(fù)骨缺損。
　　1.VEGF與Ang-1基因的克隆及腺病毒的制備
　　目的：制備同時(shí)攜帶VEGF和Ang-1基因的腺病毒，為構(gòu)建新型雙基因修飾的組織工程化人工骨提供方便的基因轉(zhuǎn)染工具。方法：采用分子生物學(xué)的方法設(shè)計(jì)、合成

3、引物，使用PCR的方法從組織中克隆出基因VEGF以及基因Ang-1，在克隆基因Ang-1時(shí)設(shè)計(jì)使用了net-PCR的方法以提高PCR反應(yīng)的靈敏度。同樣使用PCR技術(shù)從載體pIRES2-EGFP上擴(kuò)增IRES序列，繼而將基因VEGF、IRES片度以及Ang-1的基因依次裝入腺病毒的穿梭載體pAdTrack-CMV中，構(gòu)建雙基因順反子P-VIA。最后使用AdEasyTM腺病毒系統(tǒng)重組并包裝腺病毒。結(jié)果：從組織中成功地克隆出VEGF的基因序列

4、，DNA測(cè)序結(jié)果顯示克隆出的序列與Genebank中的序列完全一致；Ang-1的基因通過net-PCR提高反應(yīng)的靈敏度后也成功獲得，DNA測(cè)序結(jié)果與Genebank中的序列完全一致；擴(kuò)增出的IRES的DNA片段與商品化的載體pIRES2-EGFP中的序列完全一致。三個(gè)基因片段順次裝入載體pAdTrack-CMV后成功的構(gòu)建出同時(shí)編碼VEGF和Ang-1的雙順反子，命名為P-VIA，經(jīng)過AdEasyTM系統(tǒng)重組與包裝后，成功的制備出能夠同

5、時(shí)攜帶外源基因VEGF和Ang-1的重組腺病毒，命名為pAd-VIA。類似的過程制備出單獨(dú)攜帶基因VEGF的重組腺病毒pAd-VEGF，以及單獨(dú)攜帶基因Ang-1的重組腺病毒pAd-Ang-1。結(jié)論：成功制備出同時(shí)攜帶VEGF和Ang-1的重組腺病毒pAd-VIA，為構(gòu)建新型基因修飾型的組織工程化人工骨提供了方便的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具。
　　2.雙基因轉(zhuǎn)染MSCs體外促血管化能力研究
　　目的：研究雙基因（VEGF、Ang-1）轉(zhuǎn)染

6、后的MSCs在體外促血管化的能力，為構(gòu)建新型雙基因修飾的組織工程化人工骨打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：從兔骨髓中分離、培養(yǎng)MSCs，進(jìn)行成骨方向誘導(dǎo)、鑒定；腺病毒以感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection，MOI）分別為0、1、10、50、100、300感染MSCs以確定最佳的感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection，MOI）；以確定的最佳的感染復(fù)數(shù)的腺病毒感染MSCs，分組如下：A：腺病毒pAd-VIA；B：腺病

7、毒pAd-VEGF；C：腺病毒pAd-Ang-1；D：腺病毒pAd-VEGF+pAd-Ang-1；E：空病毒對(duì)照組。在mRNA水平及蛋白水平檢測(cè)外源基因的表達(dá)情況；從人外周血分離、培養(yǎng)、鑒定血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），將基因轉(zhuǎn)染后的MSCs與EPCs共培養(yǎng)，分組如下：A：腺病毒pAd-VIA；B：腺病毒pAd-VEGF；C：腺病毒pAd-Ang-1；D：腺病毒pAd-VEGF+pAd-Ang-1；E：未轉(zhuǎn)染對(duì)照組；F：重組VEGF蛋白組

8、；G：EGM-2培養(yǎng)基對(duì)照組，感染后進(jìn)行EPCs的增殖實(shí)驗(yàn)以及移行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果：分離、培養(yǎng)出MSCs，并成功的向成骨方向誘導(dǎo)（經(jīng)堿性磷酸酶及鈣結(jié)節(jié)染色鑒定）；不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的腺病毒感染MSCs后，發(fā)現(xiàn)MOI=100時(shí)，既可實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，也不至對(duì)宿主細(xì)胞造成過度的損傷；各組腺病毒感染MSCs后，外源基因的表達(dá)均可持續(xù)3w左右，表達(dá)的高峰出現(xiàn)在在8-9d。VEGF的表達(dá)情況：A組（腺病毒pAd-VIA組）VEGF的表達(dá)水

9、平與B組（腺病毒pAd-VEGF組）無明顯差別，略高于D組（腺病毒pAd-VEGF+pAd-Ang-1組），C組E組無VEGF的表達(dá)；Ang-1的表達(dá)：A組（腺病毒pAd-VIA組）有明顯高水平的Ang-1的表達(dá)，但其表達(dá)水平顯著低于C組（腺病毒pAd-Ang-1組）與D組的水平（腺病毒pAd-VEGF+pAd-Ang-1組），C組的Ang-1表達(dá)水平最高。B組（腺病毒pAd-VEGF組），E組無Ang-1的表達(dá)。EPCs增殖實(shí)驗(yàn)顯示兩

10、個(gè)雙基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組（實(shí)驗(yàn)組A，實(shí)驗(yàn)組D）促EPCs增殖的能力均強(qiáng)于其它各組，而A，D兩組中又以A組的促EPCs增殖的能力較強(qiáng)。促EPCs增殖能力由高到低依次為A組>D組>B組>F組>C組>G組>E組。EPCs移行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示A、B、D三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均有促EPCs移行的能力，三個(gè)組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：雙基因轉(zhuǎn)染的MSCs在體外具有良好的促血管化的能力，且使用腺病毒pAd-VIA實(shí)現(xiàn)雙基因的共轉(zhuǎn)染的效果要強(qiáng)于聯(lián)合使用腺病毒pAd-VEG

11、F和pAd-Ang-1。
　　3.雙基因轉(zhuǎn)染MSCs促進(jìn)SD大鼠缺血皮瓣存活的研究
　　目的：探討雙基因轉(zhuǎn)染的MSCs在體內(nèi)促進(jìn)血管化的能力，為構(gòu)建雙基因修飾的工程化人工骨并用于體內(nèi)修復(fù)骨缺損提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：體外培養(yǎng)大鼠的MSCs并進(jìn)行雙基因轉(zhuǎn)染；在SD大鼠的背部建立1.5cm×4.0cm的缺血皮瓣模型，將MSCs植入體內(nèi)觀察皮瓣存活情況。實(shí)驗(yàn)分組：A組：雙基因轉(zhuǎn)染的MSCs；B組：未轉(zhuǎn)染基因的MSCs；C組：

12、培養(yǎng)基DMEM對(duì)照組。27只動(dòng)物完全隨機(jī)分入A、B、C三組，每組9只動(dòng)物。MSCs懸浮于DMEM后在皮瓣邊緣多點(diǎn)注射，術(shù)后4天斷蒂。皮瓣術(shù)后即刻、24h、48h及第4天斷蒂前、斷蒂后、第7天及第14天應(yīng)用激光多普勒血液監(jiān)測(cè)儀對(duì)皮瓣中點(diǎn)及蒂部進(jìn)行皮瓣的血流灌注學(xué)檢測(cè)；皮瓣術(shù)后14天，應(yīng)用微循環(huán)顯微鏡觀察皮瓣蒂部及中點(diǎn)處的基底部毛細(xì)血管密度；分別在皮瓣術(shù)后第1、4、7、14、28天抽取外周血標(biāo)本進(jìn)行VEGF及Ang-1蛋白的ELISA檢測(cè)；

13、術(shù)后11天取材,進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，包括HE染色，CD34免疫組織化學(xué)染色以及熒光顯微鏡觀察MSCs移植體內(nèi)后的增殖情況。結(jié)果：皮瓣術(shù)后11天，大體觀察，A、B、C3組皮瓣存活率分別為：97.12％、47.28％、34.12％，A組與B組兩組間及B組與C組兩組間皮瓣存活率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組（雙基因轉(zhuǎn)染的MSCs組）的血流灌注學(xué)指標(biāo)（PU值）明顯高于實(shí)驗(yàn)組B及對(duì)照組C；微循環(huán)顯微鏡觀察皮瓣基底部毛細(xì)血管密度結(jié)果顯示，A組（雙基因轉(zhuǎn)染的M

14、SCs組）血管密度顯著高于其它兩組；術(shù)后11天，組織學(xué)檢測(cè)的結(jié)果包括H.E.染色、免疫組織化學(xué)及免疫熒光的結(jié)果均顯示A組（雙基因轉(zhuǎn)染的MSCs組）中毛細(xì)血管遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于B組及C組。植入體內(nèi)的MSCs由于標(biāo)記有熒光染料CM-DiI，在熒光顯微鏡下觀察熒光的多少以反映MSCs的增殖，結(jié)果顯示A組中MSCs增殖較B組明顯。結(jié)論：雙基因轉(zhuǎn)染的MSCs在體內(nèi)具有顯著的促血管化的活性。
　　4.雙基因修飾組織工程化人工骨的構(gòu)建及其初步應(yīng)用研究

15、r>　　目的：構(gòu)建新型雙基因修飾的組織工程化人工骨，并研究該人工骨修復(fù)兔橈骨缺損的能力。方法：快速成型技術(shù)制備多孔材料PLGA-TCP，使用I型膠原對(duì)制備的材料PLGA-TCP進(jìn)行雜化改性；電鏡觀察材料改性前后的微觀結(jié)構(gòu)，并檢測(cè)改性前后材料的親水率；將轉(zhuǎn)染雙基因及未轉(zhuǎn)染基因的MSCs分別與改性前后的材料復(fù)合，檢測(cè)細(xì)胞在材料中的增殖，ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染基因的MSCs在材料中表達(dá)外源基因（VEGF，Ang-1）的能力；建立兔橈骨1.5cm骨

16、缺損模型，將改性后的材料修剪成1.5cm×0.4cm×0.4cm大小，復(fù)合細(xì)胞后植入體內(nèi)，分組：A組：雙基因轉(zhuǎn)染的MSCs+改性的PLGA-TCP；B組：未轉(zhuǎn)染基因的MSCs+改性的PLGA-TCP；C組：?jiǎn)渭兏男缘腜LGA-TCP；D組：空白對(duì)照組。術(shù)后1、4、8周取材，進(jìn)行影像學(xué)（XRay，MciroCT）檢測(cè)及組織學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：快速成型技術(shù)制備的材料PLGA-TCP電鏡下觀察為規(guī)則、多孔的相互交通的三維立體結(jié)構(gòu)。該材料具有良好的孔

17、隙率（>90％）以及孔徑（300μm-350μm）。使用I型膠原改性后在掃描電鏡下觀察可見膠原纖維均勻分布于材料表面及孔隙中，并形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，PLGA-TCP的親水率為3.06±0.67％，改性后材料的親水性有顯著提高達(dá)到12.42±1.45％，由于改性后材料的親水性提高，接種細(xì)胞時(shí)細(xì)胞懸液漏出的少，細(xì)胞接種密度高，細(xì)胞與材料體外共培養(yǎng)7天后，電鏡觀察，細(xì)胞與材料緊密貼附。細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，改性后的材料中的細(xì)胞數(shù)量明顯多于未改性的

18、材料中的數(shù)量，而相同的材料中，未轉(zhuǎn)染基因的細(xì)胞的數(shù)量略多于轉(zhuǎn)染雙基因的細(xì)胞的數(shù)量，但差別不明顯。ELISA結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)染雙基因的MSCs在與材料復(fù)合后依然能夠高效的表達(dá)外源基因（VEGF和Ang-1）。兔橈骨1.5cm骨缺損模型成功建立，人工骨植入后1、4.、8周取材，1周時(shí)，組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行CD34免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示A組（雙基因轉(zhuǎn)染MSCs+改性的PLGA-TCP）中有大量的毛細(xì)血管，而B組（未轉(zhuǎn)染基因的MSCs+改性的PLGA

19、-TCP）中血管數(shù)量明顯少于A組，C組（單純材料組）則沒有毛細(xì)血管的生成，A、B、C三組的毛細(xì)血管密度（條/mm2）分別為：100.00±15.81、24.00±11.40、0.10±0.00，A組與B組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）B組與C組之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)行改良麗春紅三色法染色發(fā)現(xiàn)A組中有大量的軟骨陷窩形成，而B組中軟骨陷窩明顯少于A組，實(shí)驗(yàn)組C未見軟骨陷窩形成。4周時(shí)，影像學(xué)檢查顯示實(shí)驗(yàn)組(A組)橈

20、骨骨缺損部位有新骨影像形成，新骨與骨缺損兩斷端骨質(zhì)連續(xù)。實(shí)驗(yàn)組B也可見有新骨影像形成，但新骨面積少于實(shí)驗(yàn)組A，對(duì)照組C有少量新骨形成，空白對(duì)照組D無新骨形成。Lane-SandhuX線評(píng)分結(jié)果顯示，A組與B組之間，B組與C組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。組織學(xué)檢驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組A中可見明顯的編織骨形成，材料已部分降解；實(shí)驗(yàn)組B中可見少量的骨形成，但數(shù)量遠(yuǎn)少于A組，材料降解也少于A組；實(shí)驗(yàn)組C僅在邊緣處有少量的骨形成。A、B、C三組新

21、生骨組織面積比（％）分別為：20.18±6.29％、9.48±1.87％、0.2±0.15％，A組與B組之間，B組與C組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。A、B、C三組材料殘存面積比（％）分別為70.7±8.23、83.78±6.70、93.72±3.13，A組與B組之間，B組與C組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）8周時(shí)影像學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組A中橈骨缺損部位已完全被新生骨所填充，骨缺損部位塑形良好，橈骨骨折端模糊，新生骨與橈骨骨折端之