乳腺癌肺轉移相關基因的研究.pdf

1、第一部分乳腺癌不同轉移潛能細胞株表達差異蛋白的確定及其I臨床意義目的：復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科通過體內連續(xù)篩選法建立了肺高轉移潛能的乳腺癌細胞MDA-MB-435HM。該細胞與其親代細胞MDA-MB-435有相同的遺傳背景但具有更高的肺轉移潛能。本研究試圖使用蛋白質組學技術，比較兩者之間表達存在差異的蛋白，并探討其中3個蛋白在乳腺癌中的臨床意義。方法：聯(lián)合使用二維電泳(2-DE)和液相色譜．質子阱．質譜分析(LC-IT．MS)確定M

2、DA-MB-435HM細胞與其親代細胞MDA-MB-435之間表達差異的蛋白。使用實時定量RT-PCR(real-timequantitativeRT-PCR)和Western印跡的方法驗證其中3個蛋白在不同轉移潛能乳腺癌細胞株之間mRNA水平和蛋白水平的差異。使用免疫組化的方法檢測2003年1月～2004年1月，80例乳腺癌標本中3個蛋白的表達情況。 結果：共確定出11個在肺高轉移細胞MDA-MB-435HM與其親代細胞MDA

3、．MB-435之間表達存在差異的蛋白：peroxiredoxin6(PDX6)，cathepsinD前體，熱休克蛋白27(HSP27)，HSP60,原肌球蛋白l(TPMl)，TPM2，TPM3，TPM4，14-3-3proteinepsilon，腫瘤蛋白D54(tumorprotein，D54)和α結晶蛋白B鏈(AlphaB-crystallin，CRAB)。實時定量RT-PCR檢測顯示肺高轉移潛能細胞株中CRAB，HSP60和PDX6

4、的mRNA水平分別為其親代細胞的0．24倍、3．15倍和2．43倍。Western印跡分析表明CRAB的在MDA-MB-435HM中未見表達，但在MDA．MB-435細胞中表達；HSP60和PDX6蛋白在MDA-MB-435HM中上調。免疫組化染色顯示，CRAB的陽性率在淋巴結陰性乳腺癌患者中高于在淋巴結陽性乳腺癌患者中(52．5％vs32．5％)，但差異無統(tǒng)計學意義(P=-0．113)；HSP60的陽性率在淋巴結陰性乳腺癌患者中低于在

5、淋巴結陽性乳腺癌患者中(32．5％vs72．5％)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0．001)：PDX6的陽性率在淋巴結陰性乳腺癌患者中低于在淋巴結陽性乳腺癌患者中(35．0％vs72．5％，P=0．002)。結論：HSP60與PDX6水平的升高可能與乳腺癌侵襲能力增加相關，具體機制尚待進一步研究。建立乳腺癌不同肺轉移潛能的乳腺癌細胞，結合應用蛋白質組學技術，可以為發(fā)現(xiàn)乳腺癌肺轉移相關預后指標提供線索。 第二部分Trophini

6、n在乳腺癌侵襲轉移中的作用 目的：探討trophinin在不同肺轉移潛能人乳腺癌細胞株的表達情況及該基因對乳腺癌細胞MDA-MB-435增殖和侵襲轉移能力的影響。 方法：使用免疫熒光的方法檢測trophinin在乳腺癌細胞株MDA-MB-435中的定位。通過RT-PCR的方法檢測雌激素對乳腺癌細胞株MCF7和MDA-MB-435的trophininmRNA水平的影響。實時定量RT-PCR檢測trophinin在肺高轉移潛

7、能乳腺癌細胞MDA-MB-435HM和其親代細胞MDA-MB-435中mRNA水平的差異?；趐cDNAI-trophinin載體構建trophinin的表達載體pcDNA3．1(+)一trophinin。進一步通過基因穩(wěn)定轉染技術，上調MDA-MB-435細胞株的trophinin水平。觀察trophinin轉染后乳腺癌細胞株MDA-MB-435細胞增殖以及侵襲能力的改變，并運用RT-PCR和流式細胞等方法探討其可能的分子機制。進一步

8、建立相應的人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型以驗i~trophinin在體內乳腺癌移植瘤進展中的意義。 結果：Trophinin蛋白定位于細胞膜和細胞質。雌二醇可以上調雌激素受體陽性的乳腺癌細胞株MCF7的trophillinmRNA水平，在20nM濃度時MCF7細胞株的trophininmRNA水平上調達到最高水平。但雌二醇對雌激素受體陰性的乳腺癌細胞株MDA-MB-435的trophininmRNA水平無明顯影響。實時定量RT-PC

9、R分析表明乳腺癌肺高轉移細胞MDA-MB-435HM的trophininmRNA水平是其親代細胞的3．6l倍。通過穩(wěn)定轉染方法獲得trophinin更高表達的MDA-MB-435人乳腺癌細胞。RT-PCR分析表明，2個轉染trophinin后的MDA-MB-435細胞克隆的trophininmRNA水平顯著上調。轉染后細胞增殖速度無明顯增加，流式細胞分析顯示未轉染MDA-MB-435細胞株、轉染pcDNA3．1(+)空質粒的MDA-MB

10、-435細胞株以及轉染了pcDNA3．1(+)．trophinin的2個MDA-MB-435乳腺癌細胞克隆的S期比例無明顯差異，分別為44．2％，48．6％，59．2％和45．7％。RT-PCR分析表明與細胞增殖相關的cyclinA、cyclinDl和PCNA等基因的mRNA水平在轉染后無明顯變化。Transwell小室體外侵襲實驗顯示轉染組細胞有更強的侵襲能力，穿過matrigel膠的細胞數(shù)分別為平均每高倍視野(200×)81個細胞和

11、157個細胞。Trophinin轉染細胞移植瘤肺轉移灶顯著多于對照組。未轉染組，轉染空質粒組和2個轉染組的裸鼠平均肺表面轉移灶分別為26．3，24．5，53．8和54．4個。RT-PCR分析表明，轉染后與腫瘤血管生成相關的VEGF、bFGF以及與細胞侵襲能力相關的MMP2、MMP9等的mRNA水平未見明顯改變。但轉染trophinin后細胞的MMP7mRNA水平明顯增高。 結論：雌二醇可以調節(jié)雌激素受體陽性的人乳腺癌細胞株MCF