LRIG1基因抑制人腦膠質(zhì)瘤生長,侵襲及其分子機制.pdf

1、本文從以下兩部分進行闡述：
　　第一部分：研究背景與目的:促進惡性星型細胞瘤發(fā)展及侵襲演進的分子機制仍不清楚。最近,在尋找內(nèi)源性表皮生長因子受體的負調(diào)節(jié)蛋白中,我們克隆和定性LRIG1為一個抑癌基因。LRIG1在多種腫瘤中通常表達下調(diào),包括膠質(zhì)瘤。然而這種表達下調(diào)帶來的生物學(xué)作用至今仍不清楚。本研究的目的旨在揭示LRIG1基因與人腦膠質(zhì)瘤生長及侵襲的關(guān)系,并探討內(nèi)在的分子機制。方法:(第一部分)通過western blot,免疫組

2、化檢測臨床各級別膠質(zhì)瘤LRIG1表達,分析LRIG1蛋白表達差異與膠質(zhì)瘤分級的關(guān)系。在人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U251中,利用轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA質(zhì)粒干擾LRIG1表達,通過轉(zhuǎn)染帶有全長LRIG1序列的質(zhì)粒過表達LRIG1,通過G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。通過MTT,軟瓊脂克隆,PCNA免疫組化,細胞周期檢測及凋亡實驗,裸鼠皮下成瘤實驗,觀察干擾及過表達LRIG1蛋白對U251細胞系增殖的影響。通過nocodazole藥物將細胞同步化與G2-

3、M期,正常培養(yǎng),檢測過表達LRIG1對動態(tài)細胞周期的影響。通過western blot檢測相關(guān)細胞周期蛋白的表達。通過細胞侵襲及劃痕實驗,檢測下調(diào)及過表達LRIG1對U251細胞侵襲性的影響。明膠酶譜實驗檢測基質(zhì)金屬蛋白激酶(MMPs)2,9活性,實時定量PCR實驗檢測MMP1, MMP2, MMP9表達差異。Western blot檢測正常培養(yǎng)條件及EGF刺激條件下干擾及過表達LRIG1對EGFR及其下游信號通路MAPK-ERK及PI

4、3K-AKT的影響,揭示正常培養(yǎng)條件下LRIG1對轉(zhuǎn)錄因子c-Myc表達的影響。結(jié)果:LRIG1表達與膠質(zhì)瘤級別成負相關(guān)。在U251細胞中干擾LRIG1蛋白表達后,可以促進細胞增殖,過表達LRIG1蛋白后,則抑制細胞增殖。體內(nèi)實驗表明,過表達LRIG1后裸鼠皮下成瘤率下降,腫瘤直徑減小。過表達LRIG1后通過調(diào)節(jié)時序性細胞周期蛋白D1,E延遲腫瘤細胞進入細胞周期。LRIG1通過抑制MMP2,MMP9的表達從而抑制細胞的侵襲。LRIG1抑

5、制正常培養(yǎng)條件下EGFR,磷酸化EGFR,磷酸化ERK,磷酸化AKT蛋白的表達。但在EGF刺激條件下,相對于磷酸化ERK通路,LRIG1抑制PI3K-AKT信號通路更為明顯。正常培養(yǎng)條件下,干擾LRIG1促進c-Myc的表達,而過表達LRIG1后抑制c-Myc的表達。結(jié)論:LRIG1可以抑制人膠質(zhì)瘤細胞的增殖與侵襲。在膠質(zhì)瘤中恢復(fù)LRIG1表達能提供一種新的膠質(zhì)瘤治療策略。
　　第二部分：目的：構(gòu)建LRIG1基因慢病毒表達載體,轉(zhuǎn)

6、染細胞并檢測其表達,為研究LRIG1的功能打下基礎(chǔ)。方法：zeroblunt-topo-LRIG1質(zhì)粒上用EcoR I及BamH I雙酶切下LRIG1基因全長序列,瓊脂糖凝電泳,回收全長LRIG1片段。EcoR I及BamH I雙酶切慢病毒plvx-D sRedmonomer-n1載體,通過T4連接酶將全長LRIG1連接至雙酶切后載體上。慢病毒包裝系統(tǒng),plvxDsRedmonomer-n1plvxDsRedmonomer-n1-3×f