板栗殼原花青素誘導HepG2細胞自噬性死亡及其與凋亡的相關性研究.pdf

1、板栗殼是板栗(Castanea mollissima Bl.)加工過程中產生的下腳料，目前以焚燒和填埋為主，不僅對環(huán)境造成不良影響而且浪費了寶貴的資源。本研究室發(fā)現板栗殼中富含原花青素(procyanidins from chestnut shell，簡稱CSPCs)，證實CSPCs具有清除自由基和抗氧化以及抗腫瘤等生物活性，并發(fā)現CSPCs體外除了可誘導腫瘤細胞凋亡性死亡外還存在另一種死亡方式，即自噬性死亡?；诖吮菊撐囊匀烁伟〩ep

2、G2細胞為模型，采用形態(tài)學、生化和分子生物學等技術和方法，探討CSPCs誘導人肝癌HepG2細胞自噬性死亡的作用及其分子機制。在此基礎上，研究CSPCs誘導人肝癌HepG2細胞自噬和凋亡之間的相關性，進而揭示CSPCs誘導HepG2細胞死亡的途徑和分子機制。具體研究內容和結果如下:
　　1.CSPCs誘導HepG2細胞自噬性死亡及其分子機制
　　通過MTT法檢測CSPCs對HepG2細胞增殖的影響;利用MDC染色、GFP-L

3、C3質粒轉染、透射電鏡觀察自噬小泡的形成與結構;檢測活性氧的產生、線粒體膜電位變化、細胞周期變化，研究CSPCs誘導HepG2細胞自噬性死亡作用;通過western blot檢測自噬相關蛋白表達，研究CSPCs誘導HepG2細胞自噬的分子機制。結果如下:
　　(1)CSPCs對HepG2細胞增殖的抑制作用具有時間和劑量依賴效應。CSPCs作用HepG2細胞6～120 h，抑制細胞增殖的ICs0在(157.5±0.57)μg/mL和

4、(84.55±0.4)μg/mL之間。
　　(2)通過形態(tài)學和生化指標分析表明，CSPCs能夠誘導HepG2細胞發(fā)生白噬，其最佳作用時間和劑量分別為12h和300μg/mL;經形態(tài)學觀察能清晰看到自噬小體和LC3自噬蛋白熒光以及自噬小泡的結構;western blot檢測發(fā)現LC3蛋白表達增加，當使用自噬抑制劑3-MA預處理細胞后，自噬受到抑制。
　　(3)CSPCs可以誘導HepG2細胞阻滯于S期，并能誘導線粒體膜電位下降

5、，用自噬抑制劑3-MA預處理細胞后，這些現象都得到緩解。CSPCs作用HepG2細胞后活性氧(reactive oxygen species，簡稱ROS)產生量顯著增加，并存在劑量依賴性。用ROS的抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，簡稱Nac)預處理后，自噬受到抑制，細胞的存活率得到提高。CSPCs誘導HepG2自噬性死亡可能依賴于ROS的產生能力，并且與線粒體途徑有關。
　　(4)PI3K/AKT/mTO

6、R信號通路參與了CSPCs誘導的HepG2細胞自噬過程。在檢測PI3K/AKT/mTOR相關蛋白和Beclin1蛋白時發(fā)現p-AKT，mTOR，PI3K的蛋白表達隨CSPCs劑量依賴性下調，Beclin1的蛋白表達隨CSPCs劑量依賴性上調。說明該自噬經典的分子信號通路參與了HepG2細胞自噬過程。
　　2.板栗殼原花青素誘導HepG2細胞自噬和凋亡相關性研究
　　通過MTT實驗檢測自噬抑制劑3-MA和凋亡抑制劑Z-VAD對

7、150μg/mLCSPCs作用HepG2細胞48 h增殖的影響;利用MDC染色、GFP-LC3質粒轉染檢測48 h時CSPCs誘導HepG2細胞自噬效果;通過形態(tài)學和生化指標檢測細胞核固縮和細胞凋亡，研究自噬對凋亡的影響;通過western blot檢測自噬相關蛋白和線粒體相關蛋白表達，研究CSPCs誘導腫瘤細胞白噬和凋亡關系內在的分子機制。結果如下:
　　(1)自噬抑制劑3-MA和凋亡抑制劑Z-VAD預處理后CSPCs對腫瘤細胞

8、的增殖均有抑制作用，且均能削弱自噬作用。
　　(2)通過形態(tài)學和生化指標分析顯示細胞核發(fā)生聚縮和裂解，產生“凋亡小體”，流式細胞儀檢測凋亡細胞增多，細胞發(fā)生凋亡。當用3-MA和Z-VAD預處理后凋亡現象均得到抑制。表明自噬對凋亡具有一定影響。
　　(3)3-MA可以抑制PI3K，p-AKT和mTOR蛋白的表達量的下調。這表明下調PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白可以促進CSPCs誘導HepG2細胞自噬，當LC3-Ⅱ si