絲素蛋白-殼聚糖三維多孔支架材料的構(gòu)建表征與細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的基本原理和技術(shù)，再生新的骨組織，用以修復(fù)骨組織病變或缺損。其基本思路是將特異性成骨細(xì)胞種植于具有一定生物特性的并在人體內(nèi)可逐漸降解吸收的支架材料上，經(jīng)體外培養(yǎng)形成細(xì)胞生物材料復(fù)合物，然后將復(fù)合物植入人體的骨組織缺損部位，在細(xì)胞不斷增殖并分泌基質(zhì)的同時(shí)，支架材料逐步降解被人體吸收，最終形成新的具有與原功能和形態(tài)相似的骨組織[1]。
　　 骨組織工程是近年來最受關(guān)注的領(lǐng)域之一，它在解決由于創(chuàng)傷、感染

2、、腫瘤等原因所造成的骨缺損這一問題上具有很大的優(yōu)勢(shì)。在骨組織工程三要素:種子細(xì)胞、生長因子、支架材料中[2]，支架材料是骨組織工程的關(guān)鍵，它不僅將種子細(xì)胞和生長因子運(yùn)送至缺損區(qū)，還給新生骨組織提供支撐作用。目前，支架材料是骨組織工程中的研究熱點(diǎn)，尤其是復(fù)合支架材料。絲素蛋白和殼聚糖都是天然高分子材料，具有良好的生物特性及獨(dú)特的機(jī)械特性，成為近年來較熱門的組織工程學(xué)材料。
　　 本試驗(yàn)將一定濃度的絲素蛋白溶液和殼聚糖溶液以不同質(zhì)量

3、比例相混合，通過數(shù)次冷凍干燥合并化學(xué)交聯(lián)的方法制備出具有一定強(qiáng)度的多孔性支架，對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)及相關(guān)的性能進(jìn)行初步研究，篩選出適合成骨細(xì)胞生長的理想支架材料，為今后的骨缺損修復(fù)改建打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第一部分絲素蛋白/殼聚糖三維多孔支架材料的構(gòu)建及結(jié)構(gòu)表征的研究
　　 目的：
　　 通過冷凍干燥合并化學(xué)交聯(lián)的方法，制備出各種不同組分的絲素蛋白及殼聚糖的復(fù)合支架材料，對(duì)其材料結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行分析。
　　 方法：<

4、br>　　 通過CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1:2∶8（摩爾比）溶解體系溶解、過濾、濃縮提純制備出濃度為2％的絲素蛋白溶液，殼聚糖溶解于乙酸溶液配制成3％殼聚糖溶液，將二者溶液按不同質(zhì)量比混勻后，經(jīng)數(shù)次冷凍干燥以及浸泡交聯(lián)后，制得成品支架材料，采用電鏡觀察形貌，計(jì)算孔隙率并對(duì)支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行紅外光譜分析(FTIR)、X射線衍射表征(XRD)、EDS電子能譜分析。
　　 結(jié)果：
　　 絲素蛋白/殼聚糖(SF/CS

5、)內(nèi)部為三維多孔支架，尤以40％絲素蛋白-60％殼聚糖(40％SF-60％CS)組支架材料，以其適合成骨細(xì)胞直徑的孔徑大小有望成為骨組織工程中的優(yōu)良支架材料，且孔隙率保持在90％以上。本實(shí)驗(yàn)也通過紅外圖譜分析、X射線衍射分析和能譜分析，闡釋了二者混合后內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，證實(shí)了二者互為改性的試驗(yàn)方法是穩(wěn)定且成功的。
　　 第二部分絲素蛋白/殼聚糖三維多孔支架材料的理化性能及降解試驗(yàn)的研究
　　 目的：
　　 對(duì)不同組

6、分配比的SF/CS支架材料的吸水率、溶脹率進(jìn)行研究，篩選出最佳配比的組分，然后進(jìn)行該最佳組分的降解試驗(yàn)，觀察是否具有良好的降解率以適應(yīng)生物材料在體內(nèi)的降解時(shí)間，以及降解液的pH值范圍是否適合體內(nèi)進(jìn)行新陳代謝活動(dòng)。
　　 方法：
　　 制備出各個(gè)不同組分支架材料（同第一部分），通過固態(tài)支架材料浸入水中所吸收水的重量對(duì)其浸水前實(shí)測(cè)重量的百分率計(jì)算吸水率，而將固態(tài)的支架材料浸入水等溶劑液體時(shí)，濕態(tài)較其干態(tài)的體積變化的比率計(jì)算溶

7、脹率。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，得到最優(yōu)配比組為40％SF-60％CS組。將其置入人工體液(SBF)，進(jìn)行為期64天的降解試驗(yàn)，檢測(cè)絲素蛋白/殼聚糖(SF/CS)支架材料的降解速率以及降解液pH值的變化。
　　 結(jié)果：
　　 各組質(zhì)量配比的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架材料均具有良好的吸水率，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)組間差異不顯著(P＞0.05)，但溶脹率隨著絲素蛋白含量的增多而減小，在純殼聚糖組，溶脹率接近80％，與其他各組有顯著區(qū)別(P＜0

8、.05），而20％SF-80％CS組和40％SF-60％CS組的溶脹率略高于60％SF-40％CS組和80％SF-20％CS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但20％SF-80％CS組和40％SF-60％CS組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 綜合以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出40％SF-60％CS組支架材料為最優(yōu)組合，在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)40％SF-60％CS組也進(jìn)行了為期為64天的體外降解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)降解速率相對(duì)比較平穩(wěn)，最

9、初的前15天里，降解速率很快，支架材料失去了14.43％的原始重量，而在接下去的21天里，降解速率開始減慢，而在以后的28天里，降解速率變得更慢，直到64天時(shí)，支架材料僅失去了18.25％的原始重量。然而降解液pH值在長達(dá)2個(gè)月的降解時(shí)間里，一直在7.42～7.62這一狹小的范圍內(nèi)波動(dòng)，接近中性，這與體內(nèi)微環(huán)境的pH值相適應(yīng)，以上試驗(yàn)結(jié)果表明該支架材料可用于在生物體內(nèi)。
　　 第三部分絲素蛋白/殼聚糖三維多孔支架材料的生物相容性

10、及成骨性能的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：
　　 在體外實(shí)驗(yàn)中，探討40％SF-60％CS組支架材料與成骨細(xì)胞MG-63的生物相容性以及對(duì)MG-63細(xì)胞的成骨功能影響。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)分組:因?yàn)榧兘z素蛋白(100％SF)支架材料松脆，水溶液中溶失特別高，不能在水溶液中穩(wěn)定存在，故實(shí)驗(yàn)組只設(shè)為:純CS組(100％CS)和40％SF-60％CS組，而空白對(duì)照組:載玻片組。
　　 將對(duì)數(shù)生長期的

11、成骨細(xì)胞MG-63接種于各組材料上后，通過Hoechst熒光染色觀察其在材料上的生長情況，計(jì)算黏附率和增殖率，最后通過MG-63細(xì)胞分泌堿性磷酸酶(ALP)的活性及礦化結(jié)節(jié)的形成來研究支架材料的成骨性能。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用析因方差分析，為了對(duì)每一時(shí)間段組間進(jìn)行比較，采用One-WayANOVA方差分析，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 MG-63細(xì)胞在支架

12、上的生長情況良好，接種6小時(shí)后，可見細(xì)胞已經(jīng)開始黏附于支架材料的壁上，接種24小時(shí)后，大部分細(xì)胞黏附完畢，3天后，各細(xì)胞之間聯(lián)合緊密，支架材料孔壁及孔隙內(nèi)已長滿細(xì)胞。
　　 早期黏附率結(jié)果為，兩組實(shí)驗(yàn)組均顯著優(yōu)于空白對(duì)照組載玻片組(P＜0.05)，在1h，3h，6h這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)里，材料上的細(xì)胞數(shù)目是逐漸增多的，在1h和3h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，兩組實(shí)驗(yàn)組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在6h時(shí)，兩組黏附率均接近75％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義（P＞0.05）。
　　 兩組實(shí)驗(yàn)組支架上的MG-63細(xì)胞增殖率顯著高于空白對(duì)照組載玻片組。在第1天和第5天時(shí)，兩組實(shí)驗(yàn)組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而在第3天時(shí)，兩組實(shí)驗(yàn)組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　 兩組實(shí)驗(yàn)組材料對(duì)MG-63細(xì)胞分泌堿性磷酸酶均有促進(jìn)作用，與空白對(duì)照組相比差異具有顯著性意義(P＜0.05)。兩組實(shí)驗(yàn)組相比較，發(fā)現(xiàn)支架材料與MG-63共培養(yǎng)的7d，14d，21d里，差異均有顯著

14、性（P＜0.05），其中40％SF-60％CS組優(yōu)于100％CS組。
　　 Hoechst染色結(jié)果表明MG-63細(xì)胞在40％SF-60％CS組支架材料上具有良好的活性，且具有一定的增殖能力。而在礦化研究中也發(fā)現(xiàn)，無論是細(xì)胞團(tuán)聚還是基質(zhì)分泌以及最后的鈣化結(jié)節(jié)形成，40％SF-60％CS組支架材料均優(yōu)于100％CS組支架材料。
　　 全文結(jié)論：
　　 1.將濃度為2％絲素蛋白溶液與3％殼聚糖溶液相混合，互為改性，冷凍

15、干燥后能制備出各組不同組分的支架材料，通過紅外分析和xrd分析結(jié)果也印證了共混后材料結(jié)構(gòu)的微觀性能發(fā)生改變，使其不穩(wěn)定的α螺旋/無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向較為穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，且結(jié)晶程度也增強(qiáng)。其中40％SF-60％CS組，具有適合成骨細(xì)胞生長的較佳孔徑，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而成為細(xì)胞支架的首選配比。
　　 2.各組絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架材料均具有良好的吸水率，但溶脹率隨著絲素蛋白含量的增多而減小，綜合以上各條件，也篩選出40％SF-60％

16、CS組為最優(yōu)組合，對(duì)該組進(jìn)行64天的體外降解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)降解速率相對(duì)比較平穩(wěn)，降解液pH值接近中性。這與體內(nèi)微環(huán)境的pH值相適應(yīng)，這利于該支架材料在生物體內(nèi)利用。
　　 3.40％SF-60％CS組支架材料有利于MG-63細(xì)胞的早期黏附、生長、增殖，這說明經(jīng)過改性的40％SF-60％CS組支架材料有良好的生物相容性以及較佳的細(xì)胞親和力，并且可以促進(jìn)成骨細(xì)胞較旺盛的分泌細(xì)胞基質(zhì)，是一種較好的骨組織工程材料，對(duì)將來能用于骨組織工程的研