ShRNA干擾沉默Amh基因對體外培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細胞的局部調節(jié)機制研究.pdf

1、抗苗勒管激素(Anti-Müllerian hormone，AMH)是由兩個72kDa的單體通過二硫鍵連接構成的二聚體糖蛋白。AMH/MIS屬于轉化生長因子-β(TGF-β)超家族，該家族包括TGF-β、激活素-抑制素-卵泡抑素(ACT-INH-FST)系統(tǒng)和生長分化因子-9(GDF-9)等。這個家族所有的成員都是二聚體糖蛋白，都與調節(jié)組織生長與分化有關?，F(xiàn)已證實轉化生長因子-β(TGF-β)超家族/Smad信號轉導通路是調控卵泡發(fā)育的

2、重要途徑。在卵巢組織中，抗苗勒管激素表達于卵泡的顆粒細胞。已知抗苗勒管激素參與哺乳動物卵泡發(fā)育，通過自/旁分泌調節(jié)顆粒細胞的增殖分化，為了研究抗苗勒管激素對小鼠卵巢顆粒細胞的調控作用，本課題針對小鼠基因序列設計干擾片段，構建了抗苗勒管激素RNAi干擾載體pSilencer4.1-CMV-AMH，干擾顆粒細胞中抗苗勒管激素的表達，分別在mRNA和蛋白水平檢測抗苗勒管激素的表達情況，發(fā)現(xiàn)在干擾抗苗勒管激素后，顆粒細胞內發(fā)生如下變化:

3、　　1)通過Western blot檢測構建的三個抗苗勒管激素RNAi干擾載體，三個載體都顯著下調抗苗勒管激素的蛋白表達，其中干擾載體psh-AMH-2的干擾效果最好;
　　2)流式細胞儀檢測小鼠顆粒細胞干擾抗苗勒管激素后的細胞周期，發(fā)現(xiàn)較多的細胞阻滯在G1期。調控細胞周期的p21在mRNA和蛋白水平表達都顯著上調;
　　3)流式細胞儀檢測小鼠顆粒細胞干擾抗苗勒管激素后的細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細胞早期凋亡和晚期凋亡都顯著增加。通過R

4、eal time PCR和Western blot檢測抑制凋亡的Bcl-2表達情況，發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達顯著下調;
　　4)CCK-8法檢測顆粒細胞的增殖，干擾抗苗勒管激素后顆粒細胞的增殖降低;
　　5)ELISA檢測顆粒細胞分泌雌激素和抑制素B的濃度，抑制素B分泌顯著降低，雌激素也顯著降低;
　　6)通過Real time PCR檢測干擾后顆粒細胞中TGF-β超家族的抑制素各亞基(INHA、INHBA和INHBB)、