甘藍型油菜-諸葛菜附加系中雌不育和花色的形態(tài)學及轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、蕓薹科諸葛菜屬的諸葛菜(Orychophragmus violaceus(L.) O.E.Schulz，2n=24，OO)具有一些特異的形態(tài)特征（如紫花）。通過體細胞融合產(chǎn)生諸葛菜與甘藍型油菜(Brassica napusL.，2n=38，AACC)的雜種(2n=62，AACCOO)并與甘藍型油菜連續(xù)回交，獲得的一些附加系(2n=39，AACC+IO)也表現(xiàn)諸葛菜的特異形態(tài)性狀（紫花色素）及新性狀（雌不育）。本研究選取表現(xiàn)雌性不育新特性

2、和淡紅色花瓣的兩個附加系為材料，顯微解剖觀察雌性不育附加系的雌蕊發(fā)育過程，然后利用RNA-Seq技術(shù)分析雌蕊的基因表達模式，揭示雌蕊發(fā)育的遺傳調(diào)控;通過轉(zhuǎn)錄組測序分析淡紅色油菜花瓣附加系中花青素合成代謝通路，找到調(diào)控花青素合成的影響因子，并對候選基因進行轉(zhuǎn)基因驗證。主要研究結(jié)果如下:
　　1.雌不育附加系雌蕊發(fā)育的比較解剖觀察
　　與正常的甘藍型油菜比較，雌不育附加系(S1)的雌蕊完全敗育，從花蕾長度為2mm左右的早期階段就

3、發(fā)育受阻，比正常雌蕊短很多，不能結(jié)實?；ǚ酃苊劝l(fā)試驗表明S1雌蕊柱頭能粘附少量花粉粒并萌發(fā)，但花粉管螺旋生長不能穿入乳突細胞。掃描電鏡結(jié)果表明S1柱頭較小，且乳突細胞為短的圓球狀而非正常的長指頭狀。DIC觀察透明處理胚珠發(fā)現(xiàn)S1的胚珠內(nèi)外珠被都敗育，其中內(nèi)珠被能起始發(fā)育但不能繼續(xù)生長，而外珠被完全不起始發(fā)育。裸露的珠心組織內(nèi)大孢子母細胞可以進行減數(shù)分裂形成四分體，但發(fā)生異常退化且不能形成正常的功能大孢子，即胚囊發(fā)育停滯在大孢子發(fā)生階段。

4、
　　2.雌不育附加系的轉(zhuǎn)錄組分析
　　通過RNA-Seq技術(shù)對S1和甘藍型油菜受體“華雙3號”(H3)的雌蕊進行比較轉(zhuǎn)錄組分析，分別獲得7，502，922(99.14％)和6，990，973(99.03％)條clean reads。與參考基因序列Brassica_95k_unigene進行比對后分別獲得28,065和27，653個unigenes，以FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1為篩選標準，鑒定出4540個

5、DEGs（Differentially expressed genes），2155個在S1中上調(diào)，2385個下調(diào)。GO和pathway富集分析發(fā)現(xiàn)了很多與雌性發(fā)育性狀相關(guān)的過程，比如胚囊發(fā)育、雌配子體發(fā)育、細胞生長、細胞分化、細胞凋亡、花粉粒-雌蕊相互作用等。qRT-PCR實驗結(jié)果驗證了測序數(shù)據(jù)的可靠性，最后根據(jù)表型和測序數(shù)據(jù)提出了一個雌性不育植株中依賴BR、生長素、HD-ZIPⅢ基因以及它們之間相互作用的雌蕊發(fā)育模型。
　　3.

6、淡紅色花瓣附加系的轉(zhuǎn)錄組分析
　　淡紅色花瓣的二體附加系(4-10)花瓣上在原有的黃色背景下呈現(xiàn)不同深度及不同面積大小的紅色，通過對4-10和“華雙3號”(H3)，及天然的紫花(Zihua)和白花(Baihua)諸葛菜的花瓣進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得了14G的測序數(shù)據(jù)，有效reads總數(shù)為1.15億，每個樣品大約有3000萬左右的reads，接近90％為clean reads。以白菜（Brassica rapa）基因組為參考序列進行比

7、對，4-10和H3大約各有60％的clean reads唯一比對或多位點比對到基因組上，分別獲得31956和30979個基因;Zihua和Baihua都只有10％的clean reads唯一比對或多位點比對到基因組上，分別獲得30009和30275個基因。差異表達分析發(fā)現(xiàn)4-10和H3之間有9917個DEGs，Zihua和Baihua之間有3818個DEGs。對兩組DEGs分別進行基因功能分類，獲得類似的結(jié)果，在具有紫色或紅色花瓣的樣品

8、中，與光合作用及光刺激應答相關(guān)的類群都下調(diào)表達了，與蛋白質(zhì)翻譯活性相關(guān)的上調(diào)了。花青素合成相關(guān)基因的表達分析顯示大部分結(jié)構(gòu)基因在4-10和Zihua中都是上調(diào)的，特別是ANS。Baihua中只有一個調(diào)控因子GL3顯示差異表達，且下調(diào)為0;4-10中有10個調(diào)控因子為DEGs，其中顯著上調(diào)的PAP2基因經(jīng)組裝拼接和序列比對分析發(fā)現(xiàn)是來自于諸葛菜基因的轉(zhuǎn)錄本。
　　4.淡紅花附加系與諸葛菜PAP2和ANS基因過表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

9、
　　依據(jù)組裝序列及白菜基因組序列信息分別克隆了4-10和諸葛菜中的PAP2和ANS基因，結(jié)果顯示4-10中的PAP2序列與諸葛菜中的確實完全一致;4-10中獲得兩個拷貝的ANS序列，分別對應與一個白菜中的拷貝和一個甘藍中的拷貝，諸葛菜中也獲得了兩個拷貝的ANS序列。以4-10中的PAP2和其中一個拷貝的ANS序列，以及諸葛菜中其中一個拷貝的ANS序列為標準分別構(gòu)建了三個過表達載體PAP2-7、ANS-12和AZKR-7。轉(zhuǎn)化擬南