HCPT誘導肝癌細胞線粒體凋亡的比較蛋白質組分析與AIF功能研究.pdf

1、目的: 建立羥基喜樹堿(Hydroxycamptothecin，HCPT)誘導的肝癌SMMC-7721細胞線粒體凋亡模型，運用比較蛋白質組學分析鑒定線粒體凋亡前后的差異表達蛋白質，為從亞細胞器蛋白質水平進一步闡明HCPT誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡的機理奠定基礎；并對其中篩選出的差異蛋白-凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)進行功能研究。 策略與方法: 1．確定線粒體凋亡時相：用HC

2、PT處理肝癌SMMC-7721細胞，通過光鏡、MTT實驗、電鏡、流式細胞儀和AO/EB雙染等方法分別在定性、定量、早期與晚期等不同層面上檢測HCT的致腫瘤細胞凋亡活性；通過線粒體跨膜電位、激光共聚焦與western blot法等檢測線粒體凋亡的時相變化，并確定線粒體凋亡時相。 2．線粒體純度鑒定：用線粒體組分分離試劑盒分離肝癌SMMC-7721細胞線粒體，用詹納斯綠B染料對分離的線粒體進行染色鑒定；分別用核蛋白Histone、細

3、胞骨架蛋白β-actin、溶酶體蛋白Cathepsin-D和熱休克蛋白HSP60作為細胞核、細胞漿、溶酶體和線粒體的特異標志蛋白，用western blot對分離的線粒體進行純度鑒定。 3．運用比較蛋白質組分析線粒體凋亡前后的差異表達蛋白譜：通過優(yōu)化各種條件參數來確定合適的樣品上樣量、染色方法與膠條種類。按蛋白質溶解度不同將線粒體蛋白分成三個組分，對三個組份分別進行雙向電泳分離。用PDquest(7.0)軟件對掃描的二維凝膠電泳

4、圖像進行分析，篩選出線粒體凋亡前后的差異表達蛋白斑點。候選差異表達蛋白斑點經膠內胰酶酶解，MALDI-TOF-MS分析，得到肽指紋圖譜(peptide mass fingerprinting，PMF)，使用．Mascot軟件在MSDB數據庫中檢索鑒定差異表達蛋白質，并對差異蛋白質進行生物信息學分析。 4．AIF是篩選出的差異表達蛋白之一，探究在HCPT致細胞凋亡的過程中，AIF凋亡途徑是否參與其中：在用HCPI處理SMMC-77

5、21細胞后，分別用RT-PCR、westem blot法檢測AIF在mRNA與蛋白質表達水平的變化；用激光共聚焦與western blot法等檢測AIF發(fā)生亞細胞器轉位的時相變化；用DNA ladder試驗檢測DNA損傷情況。 5．AIF相互作用蛋白質的篩選：RT-PCR擴增剪切掉線粒體定位信號的人AIF基因片段并克隆入。pcDNA3.1載體，導入肝癌SMMC-7721細胞后分別通過RT-PCR、western blot法檢測A

6、IF在轉錄與翻譯水平上的表達情況。提取轉染外源AIF的細胞與對照細胞中的蛋白質，用免疫沉淀方法分離與AIF可能存在相互作用的蛋白質：用MALDI-TOF-MS對分離得到的蛋白質進行鑒定；再次用免疫共沉淀法與western blot法對篩選出的可能相互作用蛋白質進行驗證。 6．AIF蛋白的原核表達、純化及生物學活性分析：通過次序嚴密的分步克隆，將AIF基因片段亞克隆入原核表達載體pET32a(+)中。進行酶切與測序鑒定后，以構建正

7、確的重組質粒pET32a．AIF轉化大腸桿菌BL-21(DE3)菌株，在IPTG誘導下表達重組AIF蛋白，表達產物用SDS-PAGE和western blot進行鑒定；采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白；采用凝膠滯后試驗與Hoechst染色檢測重組蛋白AIF的生物學活性。 結果: 1．HCPT對肝癌SMMC-7721細胞的增殖有明顯抑制作用，半數抑制濃度(50％inhibitory concentration，IC50)約是

8、80μg/ml。當用80μg/mlHCPT對細胞處理不同時間后，細胞可發(fā)生一系列形態(tài)學變化：細胞膜的磷脂酰絲氨酸外翻，細胞核染色質固縮，呈致密濃染的凋亡狀態(tài)；超微結構觀察發(fā)現線粒體出現了腫脹性變化，線粒體跨膜電位下降并伴隨有CytC從線粒體至細胞漿的釋放。 2．分離的線粒體經詹納斯綠B染色后，呈藍綠色的顆粒狀或棒狀結構；western blot結果表明：提取的線粒體組分檢測到了線粒體標志蛋白HSP60，而檢測不到細胞核標志蛋白H

9、istone、細胞漿標志蛋白β-actin與溶酶體標志蛋白Cathepsin-D。 3．通過優(yōu)化條件，最終確定合適的樣品上樣量為200μg、最佳染色方法為銀染、最佳膠條為非線性pH3～10膠條。通過對線粒體凋亡前后的二維凝膠電泳圖像進行對比分析，發(fā)現約有39個蛋白斑點表達有差異，對其中25個差異蛋白斑點進行MALDI-TOF-MS分析后，鑒定出了20種可能的差異表達蛋白。 4．HCPT處理SMMC-7721細胞后，全細胞

10、中AIF在mRNA與總蛋白質表達水平上無變化。激光共聚焦及亞細胞器水平上的westernblot檢測結果均表明：HCPT處理細胞后，AIF從線粒體釋放并遷移至細胞核。伴隨AIF的核遷移，核DNA出現了損傷。 5．轉染的外源AIF基因，可在肝癌SMMC-7721細胞中成功表達。用免疫沉淀方法在轉染AIF的細胞中分離到了8個蛋白條帶，在對照細胞中分離到了7個與轉染組相同的蛋白條帶，并對其中一蛋白條帶進行了鑒定，此蛋白為β-actin

11、。 6．人AIF基因能在PET表達系統(tǒng)中成功表達；純化的重組蛋白AIF與DNA能有效在體外結合；重組蛋白AIF可誘導細胞核發(fā)生凋亡。 結論: 1．HCPT可通過Cgc依賴的線粒體途徑誘導細胞發(fā)生凋亡。 2．線粒體純度鑒定試驗說明：提取的細胞器組份是線粒體并且線粒體純度較高，可用于下游的蛋白質組分析。 3．鑒定出的20種差異表達蛋白可能在HCPT誘導的線粒體凋亡途徑中起重要作用。 4．HCP