RNA干擾沉默HER2基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、HER2(Her2/neu])原癌基因是人類表皮生長因子受體2(Human EpidermalGrowth Factor Receptor-type 2)的編碼基因，所編碼的蛋白為185kDa，并具有酪氨酸激酶活性。HER2在人類乳腺癌、卵巢癌、NSCLC、胃癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中存在擴(kuò)增及過量表達(dá)，并與腫瘤的侵襲性表型及生存期短密切相關(guān)。HER2癌基因的致癌機(jī)制包括：抑制凋亡，促進(jìn)存活；促進(jìn)腫瘤新生血管生成；增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力等。

2、HER2在20-25﹪的浸潤性乳腺癌中存在過表達(dá)，并具有以下特點(diǎn)： (1)HER2水平與乳腺癌的發(fā)病及預(yù)后具有很強(qiáng)的相關(guān)性； (2)HER2在人類癌細(xì)胞中的基因擴(kuò)增水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織；(3)HER2在腫瘤細(xì)胞中以很高的比例存在，高表達(dá)HER2的腫瘤通常顯示均一的、強(qiáng)烈的免疫組化染色； (4)HER2過表達(dá)不僅見于腫瘤原發(fā)灶，在轉(zhuǎn)移灶中也有過表達(dá)。上述特點(diǎn)提示，抗HER2治療會(huì)以大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)，而對(duì)正常組織的毒性較低，并可能對(duì)所

3、有部位的腫瘤都有效。因而HER2在乳腺癌中已成為重要的治療靶點(diǎn)。 目前抗HER2治療的策略有： (1)以HER2蛋白為靶點(diǎn)的治療，包括外源性阻斷抗體、干擾受體異二聚體化抗體、抗HER2疫苗、酪氨酸激酶抑制劑、細(xì)胞內(nèi)單鏈抗體等，其中曲妥珠單抗(Trastuzumab，Herceptin)是已進(jìn)入臨床應(yīng)用的人源化單克隆抗體，與化療聯(lián)合能增加有效率、延長疾病進(jìn)展時(shí)間及生存期。(2)以HER2基因?yàn)榘悬c(diǎn)的治療，包括HER2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄

4、抑制劑、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)、核酶技術(shù)、反義RNA技術(shù)等。每種策略各有其優(yōu)缺點(diǎn)。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引發(fā)的廣泛存在于生物體中的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。利用RNAi技術(shù)可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默，這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默

5、機(jī)制(post-transcriptional gene silencing，PTGS)最終抑制蛋白表達(dá)。dsRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的是21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)。由于RNAi對(duì)染色體DNA序列的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程不產(chǎn)生任何影響，具有高度的序列特異性和抑制基因表達(dá)的高效性，而且RNAi的效應(yīng)可以在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持，或在某些生物中具有遺傳性，所以迅速成為一種

6、功能強(qiáng)大的研究哺乳動(dòng)物中選擇性抑制特異性基因表達(dá)和研究基因功能的工具。 本研究目的：探討RNAi技術(shù)沉默HER2基因的效果，以及HER2基因沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞Taxol敏感性、Survivin、VEGF基因表達(dá)的影響。研究內(nèi)容分兩部分： 1．siRNA表達(dá)質(zhì)粒沉默HER2基因及其效果：GenBank查找HER2基因的mRNA序列(GenBank ID：NC-000017)，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)出3個(gè)針對(duì)HER2進(jìn)行

7、干擾作用的靶點(diǎn)，進(jìn)行Blast基因同源性分析以保證基因沉默的特異性，RNA Draw軟件分析mRNA二級(jí)空間結(jié)構(gòu)。靶序列1(基因序列23194-23214)： 5'-TCTCTGCGGTGGTTGGCATTC-3’，命名為H1；靶序列2(基因序列6945-6966)：5'-GGGAAACCTGGAACTCACCTAC-3’，命名為H2；靶序列3(基因序列27229-27251)：5'-AAGGGGCTGGCTCCGATGTATTT-3’

8、，命名為H3；無義對(duì)照目標(biāo)基因序列：5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3’，命名為CON。人工合成各單鏈DNA片段，退火形成發(fā)夾狀siRNADNA雙鏈，插入到pGenesil-1 vector U6的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之間。重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選kana抗性克隆，提取質(zhì)粒，分別對(duì)構(gòu)建的表達(dá)載體pGenesil-1質(zhì)粒(H1、H2、H3和CON)進(jìn)行測序，經(jīng)測序鑒定，確認(rèn)得到的序列為所需序列。采用METAFE

9、CTENE轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HER2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3及卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞加入G418終濃度為250μg/ml的完全RPMI-1640培養(yǎng)液。篩選3周后大部分細(xì)胞死亡，存活的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。細(xì)胞篩選出來后，采用RT-PCR和Western Blot法觀察HER2基因的沉默效果；CCK-8比色分析檢測細(xì)胞體外增殖活力及對(duì)Taxol的敏感性；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 HER2特異性si

10、RNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SK-BR-3細(xì)胞后，SK-BR-3細(xì)胞形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為皺縮、變圓、脫落；篩選出的陽性克隆生長非常慢，難以形成單層貼壁狀態(tài)，表明3個(gè)特異性HER2 siRNA對(duì)SK-BR-3細(xì)胞均有顯著的生長抑制作用。但因細(xì)胞生長緩慢，未能擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行進(jìn)一步檢測。 HER2特異性siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SK-OV-3細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)與親本細(xì)胞相似，但生長速度較緩慢。RT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了特異性HER2s

11、iRNA的細(xì)胞HER2 mRNA及p185蛋白水平均明顯低于親本細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無義對(duì)照序列的細(xì)胞；CCK-8比色分析顯示HER2基因沉默的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯低于HER2基因高表達(dá)的細(xì)胞(P=0.000)；流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析也顯示，HER2基因沉默的細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)及非增殖期的比例明顯增加(P均<0.01)，而處于合成期的比例卻顯著減少(P<0.001)，細(xì)胞周期主要阻滯于G0/G1期。HER2基因沉默的SK-OV-3細(xì)胞Taxol劑量反應(yīng)

12、曲線右移，IC50值也明顯升高，對(duì)Taxol的敏感性下降。 2．HER2基因沉默對(duì)Survivin、VEGF基因表達(dá)的影響：采用RT-PCR和WesternBlot法檢測轉(zhuǎn)染了特異性HER2 siRNA的SK-OV-3細(xì)胞Survivin與VEGF mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示HER2基因沉默的SK-oV-3細(xì)胞Survivin與VEGF mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)均明顯受抑制。 結(jié)論： 1．HER2特

13、異性siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)SK-BR-3細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用。 2．HER2特異性$iRNA表達(dá)質(zhì)粒能夠從mRNA及蛋白水平穩(wěn)定、持久地沉默SK-OV-3細(xì)胞的HER2基因。 3．HER2基因沉默可使SK-OV-3細(xì)胞增殖減慢，凋亡率增加，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。 4．HER2基因沉默可使SK-OV-3細(xì)胞對(duì)Taxol的敏感性下降。以HER2基因?yàn)榘悬c(diǎn)的RNAi治療與raxol化療聯(lián)合治療卵巢癌需慎重。