二苯乙烯苷防治骨質疏松的作用及相關機制研究.pdf

1、骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是全身性、退行性、代謝性骨骼疾病,是由多種病因導致骨組織骨量丟失、結構改變和生物力學性能減退,容易發(fā)生骨折,嚴重威脅老年人的身心健康。氧化應激(oxidative stress)是機體內活性氧自由基 ROS(Reactive oxygen species)產生過多,超出了機體的清除能力,導致氧化和抗氧化失衡的一種狀態(tài)。高濃度的ROS可以導致核酸、蛋白質、脂質產生氧化反應,損害細胞的結構和功能,

2、引起疾病的發(fā)生。許多衰老性疾病與氧化應激關系密切。目前,大量研究已經證實氧化應激在OP發(fā)生發(fā)展中起重要作用。過量的ROS的產生可以誘導成骨細胞凋亡和降低其分化能力,促進破骨細胞形成和活化,影響成骨細胞和破骨細胞之間的偶聯,進而降低骨形成,促進骨吸收,使骨量減少。骨質疏松病人血漿氧化應激水平升高同骨密度降低具有相關性。因此,利用抗氧化劑來防治OP成為研究熱點。流行病學研究發(fā)現許多營養(yǎng)物質及中藥具有抗氧化作用,進而發(fā)揮骨保護作用。二苯乙烯苷

3、(TSG)是從傳統(tǒng)中藥何首烏中提取的有效成分之一,具有抗氧化功效。那么,TSG能否應用于治療OP呢?目前還未見相關報道。
　　本實驗分為三部分,擬通過在體外研究 TSG對氧化應激造成的成骨前體細胞MC3T3-E1凋亡和成骨分化抑制的逆轉作用及在體內研究小鼠去卵巢骨質疏松模型中,TSG能否提高骨密度,改善骨組織微結構,進而改善OP,并對其相關機制進行初步探討。本研究可以提供TSG治療OP的新用途,為尋找治療OP的中藥提供理論依據。<

4、br>　　1 TSG對氧化應激導致的成骨前體細胞MC3T3-E1凋亡的預防作用及機制研究
　　目的研究TSG對氧化應激導致的成骨前體細胞MC3T3-E1凋亡的預防作用,并初步探討相關機制。方法建立體外氧化應激模型,100、200、300和400μM/L的H2O2分別作用2h、6h、12h和24h,MTT法評價細胞存活情況,篩選合適H2O2作用濃度;觀察不同濃度0.01、0.1、1、10、50μM/L TSG對成骨前體細胞MC3T3

5、-E1增殖作用的影響,評價藥物的毒性作用;篩選的合適濃度的TSG和 H2O2共同作用,實驗分組:①空白對照組;②單純H2O2處理組;③H2O2+TSG0.1μM處理組;④H2O2+TSG1μM處理組;⑤H2O2+TSG10μM處理組;⑥陽性對照抗氧化劑NAC1mM處理組。通過MTT法、顯微鏡下大體觀察、Hoechst33258染色及流式細胞儀來評價細胞凋亡情況及TSG對氧化損傷的保護作用;利用熒光酶標儀和MDA檢測試劑盒來檢測細胞中RO

6、S及MDA的水平來評價細胞的氧化應激狀態(tài);Western-blot和RT-PCR分別從蛋白水平和基因水平評價Bcl-2和Bax的表達水平,初步闡述TSG對氧化應激損傷保護作用的相關機制。結果篩選出合適H2O2作用濃度為300μM/L,作用24h,用于后續(xù)研究;TSG在觀察濃度內對MC3T3-E1無毒性作用(P>0.05);與空白對照組相比,單純H2O2處理可以導致細胞死亡,顯微鏡下大體觀察可見許多細胞已死亡,脫壁;Hoechst3325

7、8染色可見有較多的細胞出現核固縮、核濃集現象;不同濃度的TSG預處理后,細胞凋亡現象得到改善;流式細胞儀檢測結果提示:空白組、H2O2處理組、不同濃度TSG預處理組及NAC處理組的細胞凋亡率分別為5.8％、30.1%、22.1%、15.3%、14.3%、9.2%?？梢?單獨H2O2作用可以導致成骨前體細胞出現較大程度的凋亡,不同濃度TSG預處理后,細胞凋亡率有所降低(P<0.05);單純H2O2作用可以導致細胞水平的ROS和脂質氧化產物

8、 MDA產生增加,TSG(1-10μM)可以顯著降低細胞水平 ROS和 MDA水平(P<0.05),改善細胞的氧化應激狀態(tài);Western-blotting和實時定量 RT-PCR結果提示:TSG預處理可以減少H2O2處理后促凋亡蛋白Bax的表達,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。結論氧化應激可以導致成骨前體細胞MC3T3-E1凋亡增加,TSG可以通過降低氧化應激水平及改善線粒體凋亡Bcl-2/Bax信號通路來起到保護作用。
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9、 TSG對氧化應激導致的成骨前體細胞MC3T3-E1成骨分化能力降低的預防作用及機制研究
　　目的探討TSG對氧化應激導致的成骨前體細胞MC3T3-E1成骨分化能力降低的預防作用及相關機制研究,為體內實驗奠定理論基礎。方法將成骨前體細胞MC3T3-E1均勻接種到六孔板內,待細胞達80%鋪滿時,給予成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗分組:①空白對照組;②單純H2O2處理組;③H2O2+TSG0.1μM處理組;④H2O2+TSG1μM處理組;⑤

10、H2O2+TSG10μM處理組;⑥NAC1mM處理組。誘導6、14或21天后,依組分別給予不同濃度TSG預處理24h,然后給予H2O2處理24h。通過ALP染色及ALP定量分析來評價成骨分化的標志物ALP的表達如何;通過茜素紅染色來評價成骨細胞的礦化程度;通過實時定量 RT-PCR來檢測成骨分化相關基因 ALP、COL-1和OCN的表達情況。為了進一步闡明相關的作用機制,我們利用熒光酶標儀檢測成骨細胞內ROS的水平及MDA試劑盒檢測脂質

11、氧化水平來反應細胞內的氧化應激水平,并利用ELISA試劑盒檢測骨吸收相關因子RANKL和IL-6的表達水平。結果同空白對照組相比,單純 H2O2處理可以明顯降低成骨分化標記物 ALP染色和定量結果;減少細胞外基質鈣沉積量;下調成骨分化相關基因ALP、COL-1和OCN的表達水平(P<0.05)。當 TSG預處理24h后,TSG(0.1-10μM)以劑量依賴方式明顯改善ALP活性(P<0.05);改善ALP染色和鈣結節(jié)沉積;顯著提高成骨分

12、化基因ALP、COL-1和OCN的表達水平(P<0.05)。單純H2O2處理,細胞內ROS及MDA水平顯著提高,而TSG(1-10μM)預處理可以明顯降低ROS及MDA水平(P<0.05)。ELISA檢測也得出相同的結果,TSG(0.1-10μM)及(10μM)分別降低 H2O2作用導致的RANKL和 IL-6的升高(P<0.05)。結論氧化應激可以導致成骨前體細胞MC3T3-E1成骨分化能力抑制,TSG可能部分通過降低氧化應激水平及骨

13、吸收因子的表達,在一定程度上逆轉這種抑制作用。
　　3 TSG對小鼠去勢骨質疏松模型的預防作用
　　目的研究 TSG對小鼠去勢骨質疏松模型中骨密度、骨量及骨組織微結構改變的預防作用。方法32只9月齡BALB/c雌性小鼠,平均體重為19.73±2.011g,隨機分為四組:①假手術組(SHAM);②單純卵巢去勢組(OVX);③卵巢去勢并小劑量TSG處理組(OVX+TSG5mg/kg);④卵巢去勢并高劑量TSG處理組(OVX+TS

14、G20mg/kg)。戊巴比妥鈉(50 mg/kg i.p.)麻醉成功后,通過背側入路移除雙側卵巢,術后7天,依分組情況每天給予腹腔注射藥物或雙蒸水,持續(xù)3個月。心臟采血,離心后,取血清用于檢測MDA和GSH表達水平,來評價血清中的氧化應激狀態(tài)。取第4腰椎及左側股骨,剔除周圍軟組織,4%多聚甲醛固定后,用于顯微 CT(Micro-CT)、HE染色、VG染色和Von kossa染色來評價TSG對骨密度、骨量及骨組織微結構的作用程度。結果與S

15、HAM組相比,OVX組血清中MDA水平升高、GSH水平降低(P<0.05)。OVX+TSG20mg/kg可以明顯改善血清中 MDA水平(P<0.05),但對于GSH水平的改變無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。不同劑量TSG處理組之間也無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Micro-CT結果提示:與SHAM組相比,OVX組的第四腰椎及股骨遠端松質骨骨量減少,BV/TV、Conn.D、Tb.N、Tb.Th及 BMD值減少(P<0.01),SMI和Tb

16、.Sp增加(P<0.05)。OVX+TSG20mg/kg可以明顯改善去卵巢導致的這些骨組織微結構參數的改變(P<0.05)。OVX+TSG5mg/kg可以改善骨組織微結構參數值,但不具有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。不同劑量TSG處理組之間也無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。脫鈣骨組織石蠟切片HE染色及不脫鈣骨組織塑料包埋切片VG和Von kossa染色結果均提示:OVX組與SHAM組相比,骨小梁數量減少,間距增大,而經不同濃度 TSG處理后