微小RNA-122與脂肪性肝病發(fā)病關系的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　脂肪性肝病(FLD)俗稱脂肪肝，包括酒精性脂肪性肝?。ˋLD）和非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD），是指脂質在肝臟組織內沉積超過肝臟重量的5％，或光鏡下＞30%的肝細胞出現(xiàn)脂變的臨床綜合征。NAFLD的病理類型包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）及肝硬化，后者可發(fā)展為肝癌[1]。近年隨著生活水平提高和飲食習慣改變，NAFLD的患病率不斷提高，我們在廣東省城鄉(xiāng)人群調查發(fā)現(xiàn)脂肪肝患病率已達15%，接近發(fā)達國家20%-

2、30%水平[2，3]。NAFLD的發(fā)病機制尚不完全清楚，治療選擇有限。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長約21～22核苷酸的小分子非編碼RNA，是動植物細胞內重要的轉錄后基因表達調控因子，通過RNA干擾，降解或抑制靶mRNA的翻譯，調控蛋白編碼基因的表達，在細胞生長、分化和死亡等過程中起重要作用，其表達的失調會引起疾病。miRNAs與腫瘤的關系報告最多，而與代謝性疾病及 NAFLD關系的研究較為欠缺[4]。本文探

3、討肝細胞株miR-122表達水平與肝脂肪變的關系，并觀察轉染模擬物miR-122前體（pre-miR-122）和抑制物miR-122抗體（anti-miR-122），對脂肪變肝細胞miR-122表達和脂肪含量的影響，從分子水平探討NAFLD診斷的新標記物和治療的新靶點。
　　目的：
　　探討肝細胞株脂肪變后miR-122表達水平的變化，觀察轉染pre- miR-122及anti-miR-122對脂肪變肝細胞的miR-122表

4、達和脂肪含量的影響。
　　方法：
　　1．用油酸誘導法建立肝細胞株（L-02）脂肪變模型。
　　2．制作正常肝細胞及油酸誘導24h、48h、72h的脂肪變細胞爬片：用親脂性熒光染料尼羅紅染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內脂滴情況。利用Olympus Fluview ver.3.0 viewer軟件分析細胞內脂滴熒光強度。同時用甘油三酯試劑盒檢測正常肝細胞、油酸誘導24、48、72小時細胞株的甘油三酯含量。
　　3．

5、檢測miR-122表達：提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，用熒光定量PCR檢測正常肝細胞及油酸誘導脂肪變細胞miR-122的表達。
　　4．轉染miR-122模擬物和抑制物：瞬時轉染按照Lipofectamine2000說明書進行。除未轉染脂肪變細胞組外，設模擬物實驗組（miR-122 mimic）、模擬物對照組（mimic C）、抑制物實驗組（anti-miR-122）、抑制物對照組（inhibitor C）。分別用合成的pr

6、e-miR-122及其對照物、anti-miR-122及其對照物進行轉染，干擾后6小時評價轉染效率，72小時檢測miR-122表達水平，同時觀察轉染前后細胞內脂滴變化。
　　5．統(tǒng)計分析各實驗組數據以均數±標準差表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。滿足正態(tài)分布或經轉換后滿足正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，分布不滿足正態(tài)時采用非參數檢驗，顯著性水平為P<0.05。
　　結果：
　　1．成功建立體外脂肪

7、肝細胞株模型：油酸誘導24h、48h、72h細胞內出現(xiàn)紅色脂滴。應用激光共聚焦顯微鏡結合Olympus Fluview ver.3.0 viewer軟件對脂滴進行分析，顯示脂肪變肝細胞內脂滴平均熒光強度顯著高于對照肝細胞（24h時860.01±26.52 vs257.77±29.69）（P<0.001），且隨著油酸誘導時間延長（24h、48h、72h），脂肪變肝細胞內脂滴平均熒光強度逐漸增強（P<0.05）。用甘油三酯試劑盒檢測細胞內甘

8、油三酯含量顯示，脂肪變肝細胞內甘油三酯含量較對照肝細胞顯著增加(24h時3.47±0.116 vs1.865±0.015)（P<0.01），并隨著油酸誘導時間延長（24h、48h、72h）而逐漸增加（P<0.05）。
　　2．脂肪變肝細胞 miR-122表達顯著下調，其表達拷貝數僅為正常肝細胞的1/21.74（P<0.05）。
　　3．脂肪變肝細胞轉染對照物mimic C和inhibitor C后，兩對照組miR-122表達

9、和未轉染的脂肪變肝細胞比較差異不顯著（P>0.05）。而轉染miR-122 mimic后，脂肪變肝細胞miR-122的表達顯著增加，是未轉染的脂肪變細胞2.96倍（P<0.05），其細胞內脂滴平均熒光強度（790.92±46.72）較未轉染脂肪變肝細胞（1022.16±49.66）顯著減少（P<0.05）；轉染 anti-miR-122后，脂肪變肝細胞miR-122的表達量顯著減少，是未轉染的脂肪變肝細胞1/3.45（P<0.05），其

10、細胞內脂滴平均熒光強度（1386.49±403.44）較未轉染脂肪變肝細胞（1022.16±49.66）顯著增加（P<0.05）。
　　結論：
　　1．肝細胞脂肪變后miR-122表達顯著下降。
　　2．對脂肪變肝細胞轉染miR-122模擬物后細胞內miR-122表達顯著增高，而脂含量顯著減少；轉染miR-122抑制物后細胞內miR-122表達顯著降低，而脂含量顯著增加。
　　3．miR-122參與脂肪性肝病的發(fā)