間質(zhì)成纖維細胞在食管癌變進程中的作用及機制的研究.pdf

1、食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，5年生存率低，浸潤和轉(zhuǎn)移是影響患者死亡及預(yù)后的重要因素。食管癌具體發(fā)生機制尚不明確，以往關(guān)于食管癌的研究多專注于惡變的鱗狀上皮細胞，而很少關(guān)注上皮細胞周圍的間質(zhì)微環(huán)境，近年來，腫瘤間質(zhì)微環(huán)境的研究逐漸成為研究熱點?；罨陌┫嚓P(guān)纖維母細胞(Cancer-associated fibroblasts CAFs)

2、是腫瘤間質(zhì)微環(huán)境內(nèi)的主要效應(yīng)細胞，研究證實，包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤組織內(nèi)的癌相關(guān)纖維母細胞，與正常成纖維細胞相比，在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長方式、增殖活性、運動能力等發(fā)面均發(fā)生了顯著變化，并且能夠分泌大量的促進腫瘤細胞增殖、血管新生的信號分子以介導(dǎo)上皮-間質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用。
　　目的:
　　食管癌的發(fā)展是一個漸進的過程，從正常鱗狀上皮發(fā)展到鱗狀細胞癌的過程中存在中間過渡階段—不典型增生鱗狀上皮或異型增生鱗狀上皮，此種上皮與正常鱗

3、狀上皮和癌上皮細胞有著不同的結(jié)構(gòu)與功能，在癌前病變間質(zhì)組織中，是否也存在正常成纖維細胞向癌相關(guān)纖維母細胞轉(zhuǎn)化的過渡階段-不典型增生間質(zhì)成纖維細胞尚不知曉，與正常成纖維細胞和癌相關(guān)纖維母細胞相比，其結(jié)構(gòu)和功能特性又會有何不同，在食管癌變進展中起到何種作用，具體作用機制如何，均有待研究證實。食管間質(zhì)成纖維細胞在食管癌變進程中扮演何種角色，深入研究其具體作用機制可能有助于食管癌及食管癌前病變的早期診斷，早期治療，為食管癌及食管癌前病變的藥物治

4、療提供作用靶點。
　　方法:
　　研究食管癌變過程中間質(zhì)成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)變規(guī)律及間質(zhì)成纖維細胞相關(guān)蛋白的表達變化，采用免疫組織化學(xué)方法檢測食管正常組、低級別上皮內(nèi)瘤變組、高級別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組及進展期癌組間質(zhì)和上皮組織中α-SMA、TGFβ1、smad4、HGF、c-met、MMP2、MMP9及VEGF表達變化，計數(shù)各組微血管密度，統(tǒng)計分析各組指標與病變的相關(guān)性，統(tǒng)計分析間質(zhì)表達α-SMA與TGFβ1、HGF的相關(guān)性

5、，統(tǒng)計分析間質(zhì)TGFβ1與上皮smad4，間質(zhì)HGF與上皮c-met的表達相關(guān)性;體外分離培養(yǎng)人食管不同病變階段組織中的間質(zhì)成纖維細胞，包括食管正常成纖維細胞（normal fibroblasts，NFs）、食管不典型增生成纖維細(atypical hyperplasiafibroblasts，AFs)、食管癌相關(guān)纖維母細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)，觀察三種間質(zhì)成纖維細胞的形態(tài)學(xué)特征，檢測

6、各自的免疫表型和生物學(xué)特性，細胞內(nèi)相關(guān)基因的表達變化，組織塊貼壁法和酶消化法體外培養(yǎng)三種食管間質(zhì)成纖維細胞，采用倒置相差顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察細胞大體形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，瑞氏-吉姆薩染色方法，觀察細胞著色情況，細胞免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測細胞表面蛋白，包括角蛋白(cytokeratin，CK)、波形蛋白(Vimentin，Vim)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)的表達情況，采用四氮唑藍比色法繪制

7、NFs，AFs及CAFs7天生長曲線，流式細胞術(shù)檢測NFs，AFs及CAFs細胞周期，RT-PCR技術(shù)檢測細胞內(nèi)α-SMA、TGFβ1、HGF、MMP2、MMP9及VEGF-A的基因表達，Transwell技術(shù)檢測癌細胞分別與三種間質(zhì)成纖維細胞間接接觸前后，4種細胞內(nèi)基因的表達變化，同時檢測癌細胞對間質(zhì)成纖維細胞侵襲力的影響;體外模擬微環(huán)境分析三種間質(zhì)成纖維細胞與癌細胞體外間接接觸作用機制，建立動物模型，體內(nèi)研究三種間質(zhì)成纖維細胞與癌細

8、胞直接接觸作用機制。將癌細胞株分別與三種食管間質(zhì)成纖維細胞混合注射于裸鼠皮下，構(gòu)建實驗動物模型，觀察成瘤時間、成瘤率以及腫瘤增長速度，免疫組化檢測間質(zhì)成纖維細胞的表型變化，PCNA蛋白染色檢測食管癌細胞的增殖能力變化，CD34標記血管內(nèi)皮細胞以檢測腫瘤間質(zhì)微血管密度。
　　結(jié)果:
　　第一部分:隨食管癌變進展，食管間質(zhì)成纖維細胞的表型發(fā)生了轉(zhuǎn)變，由α-SMA陰性表達轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃员磉_，且呈逐漸增高趨勢;間質(zhì)和上皮中TGFβ1、H

9、GF、MMP2、MMP9蛋白表達均逐漸上升，上皮中c-met蛋白表達亦呈逐漸上升趨勢，而smad4蛋白表達呈下降趨勢，間質(zhì)中VEGF蛋白表達逐漸升高。在間質(zhì)成纖維細胞中α-SMA與TGFβ1、HGF表達呈正相關(guān)。隨食管癌變進展，MVD值逐漸增高，MVD值與TGFβ1、HGF和VEGF表達呈正相關(guān)。
　　第二部分:體外成功培養(yǎng)出食管正常成纖維細胞、不典型增生成纖維細胞和癌相關(guān)纖維母細胞，純化后的細胞純度達到95％。光鏡下觀察，三種間

10、質(zhì)成纖維細胞呈扁平長梭形，大小基本一致，突觸較多，食管正常成纖維細胞間存在密度抑制和接觸抑制，而不典型增生成纖維細胞和癌相關(guān)纖維母細胞抑制和接觸抑制消失，細胞排列紊亂，局部出現(xiàn)重疊生長的現(xiàn)象;電鏡下觀察，食管三種成纖維細胞富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基體，食管正常成纖維細胞內(nèi)可見微絲，不典型增生成纖維細胞和癌相關(guān)纖維母細胞內(nèi)可見大量微絲，局部形成微絲束，甚至成團形成致密斑。三種間質(zhì)成纖維細胞角蛋白染色均為陰性，波形蛋白染色均為陽性，食管

11、正常成纖維細胞的α-SMA染色為陰性，食管不典型增生成纖維細胞和癌相關(guān)纖維母細胞α-SMA表達均為陽性。NFs、AFs和CAFs生長曲線均為S形，3-5d為對數(shù)生長期，細胞生長旺盛，CAFs是活化的成纖維細胞，增殖能力明顯強于NFs和AFs，AFs增殖能力則介于NFs和CAFs之間，接近于CAFs。NFs，AFs，CAFs組處于S期細胞百分比分別為23.7，32.8，33.4。
　　第三部分:從NFs→AFs→CAFs，Vimen

12、tin mRNA的表達無變化，α-SMA mRNA的表達逐漸增強，TGFβ1，HGF，MMP2，MMP9 mRNA在NFs、AFs、CAFs中表達水平依次增高。 VEGF-A在NFs未見表達，在AFs、CAFs中高表達。三種食管間質(zhì)成纖維細胞分別與食管癌細胞ECa109間接共培養(yǎng)后，TGFβ1，HGF，MMP2，MMP9均表達增強。NFs對ECa109無明顯促進增殖作用，而AFs、CAFs刺激食管癌細胞株ECa109細胞內(nèi)PCNA表達量

13、顯著增加，促進ECa109的增殖。侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，空白對照組中僅有少量食管癌細胞穿透Matrigel，到達濾膜下方的細胞數(shù)為（18.0±5.4）個，NFs組到達濾膜下方的細胞數(shù)為(35.0±4)個，AFs和CAFs作用下濾膜下方的細胞數(shù)分別為(125.2±7.1)、(135.5±8)個。動物模型結(jié)果顯示，食管間質(zhì)成纖維細胞與癌細胞株混合注射可明顯縮短成瘤時間，提高成瘤率，腫瘤內(nèi)微血管密度增加，從而加速腫瘤的生長。
　　結(jié)論:

14、　　1、在食管癌變進程中，食管正常間質(zhì)成纖維細胞與癌相關(guān)纖維母細胞間存在中間過渡階段-食管不典型增生成纖維細胞。從正常成纖維細胞→不典型增生成纖維細胞→癌相關(guān)纖維母細胞，其免疫表型逐步發(fā)生了改變。
　　2、體外可成功培養(yǎng)三種食管間質(zhì)成纖維細胞。從正常成纖維細胞→不典型增生成纖維細胞→癌相關(guān)纖維母細胞，細胞功能越發(fā)活躍，生物學(xué)特性發(fā)生了改變，處于增殖期細胞比例增高。
　　3、癌細胞可通過旁分泌細胞因子，間接刺激食管間質(zhì)成纖維細