穿膜肽介導的眼內(nèi)基因遞送系統(tǒng).pdf

1、眼內(nèi)新生血管性疾病是一類眼部的高發(fā)病變，可引起包括老年黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫等致盲性眼部疾病。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)在眼內(nèi)新生血管性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，成為主要的治療靶點之一。目前臨床上采用整合素、單克隆抗體、適配體及干擾RNA等藥物拮抗VEGF，起到抑制新生血管形成的作用。這類治療用生物大分子由于分子量大、親水性強，通過滴眼的方式給藥很難吸收到達

2、眼后段，必須采用玻璃體內(nèi)注射給藥，導致患者順應性差。因此,如何改善此類藥物通過非損傷途徑給藥的眼部吸收是藥劑學工作者關注的焦點。
　　細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一類具有穿透細胞膜能力的短肽，一般由不超過30個氨基酸殘基構成，分子整體帶正電荷。CPP以非受體依賴方式穿過細胞膜，轉導效率高且不易造成細胞損傷。目前常用的CPPs有TAT（轉錄蛋白反式作用子）、聚精氨酸、穿膜素（penet

3、ratin或transportan）等，利用這些CPPs已成功地將蛋白質(zhì)、核酸、納米粒、脂質(zhì)體等多種生物大分子或納米制劑遞送到細胞中。
　　本文旨在從目前研究較成熟的穿膜肽中篩選出一種眼部透過性及安全性良好的穿膜肽。并構建一種CPPs介導的非損傷性眼部基因遞送系統(tǒng)，改善基因藥物經(jīng)由結膜囊內(nèi)給藥在眼后段的吸收，取代目前常用的玻璃體內(nèi)注射的給藥方法，提高患者順應性，為實現(xiàn)生物活性大分子藥物的眼部遞送提供新途徑。
　　本文第一部分

4、針對Penetratin、Protamine、TAT、Poly(arginine)8四種備選穿膜肽及電中性的Poly(serine)8對照肽展開了體內(nèi)外評價。采用結膜細胞攝取實驗、細胞毒性實驗、家兔離體角膜透過性實驗和大鼠在體結膜囊內(nèi)給藥觀測眼內(nèi)分布等一系列評價方法，系統(tǒng)地對CPPs的眼部透過性進行研究。我們發(fā)現(xiàn)，在四種備選穿膜肽中，Penetratin具有最強的眼部透過性及安全性，細胞攝取量是對照肽Poly(serine)8的16～2

5、9倍，離體角膜表觀透過系數(shù)達到對照肽的87.5倍;結膜囊內(nèi)給藥能夠快速吸收，且在眼后段廣泛分布。采用圓二色譜對四種穿膜肽的構象進行比較發(fā)現(xiàn)，Penetratin的眼部透過性與其兩親性及獨特的脯氨酸二型螺旋構型有關。此外，選取了與備選穿膜肽氨基酸序列相同的D構型穿膜肽進行比較研究，結果發(fā)現(xiàn)構型發(fā)生轉換后穿膜肽的眼部透過性減弱，因而確定了L構型的Penetratin作為下一步研究中采用的優(yōu)選穿膜肽分了。
　　本文第二部分采用紅色熒光蛋

6、白質(zhì)粒(pRFP)、低分子量分枝狀陽離子聚合物（Low molecular weight Branched Cationic Polymer，LBCP)與穿膜肽Penetratin(P)設計并制備了兩種不同結構的物理復合物pRFP/P與pRFP/LBCP/P，采用靜電結合方式壓縮報告基因，并對其進行了處方篩選、結構確證和理化性狀表征。優(yōu)化得到兩種物理復合物的基本處方:復合物pRFP/P處方中Penetratin與pRFP的電荷比為20∶

7、1;復合物pRFP/LBCP/P中LBCP與pRFP的氮磷比為5∶1，Penetratin與pRFP的電荷比為20∶1。采用超濾離心法對復合物的形成進行了驗證。兩種復合物pRFP/P與pRFP/LBCP/P的粒徑分別在400nm和100～200 nm左右，其中PAMAM參與形成的處方粒徑小于其他各組，顯示出更強的基因壓縮效果和結合穿膜肽的能力。透射電鏡實驗結果證實各組物理復合物的外觀圓整均一，顆粒大小與粒徑測定結果相符。
　　本文

8、第三部分針對前文制備優(yōu)化得到的復合物處方進行了體內(nèi)外多水平的系統(tǒng)評價，采用人結膜細胞與角膜細胞作為體外模型對各組復合物進行了體外轉染效率的定性定量考察、細胞攝取機理探究等相關研究。篩選得到了用于眼部基因遞送的最優(yōu)處方:pRFP/P20及pRFP/PAMAM/P20+ PAMAM5。大鼠在體結膜囊內(nèi)給藥實驗證實，二者在眼內(nèi)均可達到較好的轉染效果。眼部藥動學實驗結果表明兩種復合物經(jīng)滴眼給藥可以快速吸收入眼，并且在眼后段滯留時間長達8h以上。