基因芯片技術篩選和鑒定結直腸癌腹膜種植轉移相關基因.pdf

1、研究背景和目的:
　　 腹膜種植轉移是結直腸癌常見的轉移方式，文獻報道結直腸癌腹膜轉移的發(fā)生率約13％，有7％的結直腸癌患者在首次手術時就發(fā)現(xiàn)腹膜種植轉移，另有4％～19％的患者在根治術后出現(xiàn)腹膜種植轉移。結直腸癌腹膜轉移的預后很差，中位生存期只有5～9個月，因此，鑒定結直腸癌腹膜轉移的生物學標記對早期診斷及判斷預后都具有重要意義?；蛐酒夹g由于具有高通量檢測基因表達變化的特點，所以被廣泛應用于腫瘤生物學標記的篩查。目前，大量

2、研究證實結直腸癌原發(fā)腫瘤組織和肝臟、淋巴結轉移組織中存在大量差異表達基因，但腹膜轉移組織和原發(fā)腫瘤組織中有哪些基因存在表達差異，國內(nèi)外報道甚少。理論上，根據(jù)腫瘤平行生長模型，在腫瘤發(fā)生的早期，一些不具有全部惡變基因的腫瘤細胞就可以出現(xiàn)播散，并在遠處其他組織內(nèi)繼續(xù)通過基因突變來適應新的微環(huán)境的變化，最終形成轉移灶，由于外部環(huán)境選擇的壓力和內(nèi)在基因的不穩(wěn)定性，使這些轉移細胞的基因和原發(fā)腫瘤的基因差異很大。因此，借助于基因芯片技術比較結直腸癌

3、原發(fā)腫瘤組織與腹膜轉移組織全基因組mRNA表達水平的差異，就可以找到結直腸癌腹膜轉移相關的基因。為此，我們首先從南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院普外科自主開發(fā)的結直腸癌外科病例管理與分析系統(tǒng)軟件中提取748例結直腸癌病人數(shù)據(jù)，對臨床病理資料進行回顧性分析，應用SPSS統(tǒng)計軟件探討結直腸癌腹膜轉移發(fā)生的危險因素，并確定基因芯片實驗所需的病人及標本收集范圍。采用基因芯片技術比較4例結直腸腺癌原發(fā)腫瘤組織和配對的4例腹膜轉移組織全基因組mRNA表達水

4、平的差異，通過倍數(shù)法確定差異表達的基因，并對這組基因進行功能注釋聚類分析，通過對腫瘤進展相關的功能類中基因的分析，探討結直腸癌腹膜轉移的分子機制。由于基因芯片技術有一定的假陽性率，因此對部分基因芯片技術篩選出的差異表達基因進行RT-PCR驗證。通過上部分實驗，我們最終確定膠原三股螺旋重復蛋白1（CollagenTripleHelixRepeatContaining1，CTHRC1）與結直腸癌腹膜種植轉移密切相關，為近一步驗證CTHRC1

5、蛋白表達水平的差異，采用免疫組化的方法檢測了40例正常組織、66例結直腸原發(fā)癌組織、42例腹膜轉移癌組織及5年隨訪期內(nèi)無腹膜轉移發(fā)生的68例結直腸原發(fā)癌組織的CTHRC1蛋白表達情況，探討CTHRC1蛋白表達與臨床病理數(shù)據(jù)之間的關系，比較不同強度CTHRC1蛋白表達組間病人術后累積總生存率及無病生存率的差異，并以病人的臨床病理數(shù)據(jù)及CTHRC1表達水平為自變量，構建Cox回歸模型，最終證實CTHRC1蛋白表達陽性是影響病人術后生存的危險

6、因素。除比較原發(fā)腫瘤組織與腹膜轉移組織間差異表達基因外，還通過基因芯片技術比較了原發(fā)腫瘤組織和正常組織間的差異表達基因，并對部分基因進行RT-PCR驗證。通過不同組織間差異表達基因的比較，有助于了解結直腸癌腹膜轉移的分子機制，尋找理想的腹膜種植轉移標記物，從而為早期發(fā)現(xiàn)、預防及治療結直腸癌的腹膜種植轉移提供可靠的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一章:回顧分析2003年1月～2008年12月南方醫(yī)院普外科收治的結直腸癌患

7、者的臨床病理資料，根據(jù)術中探查及術后病理結果，將病人分為腹膜轉移組和無轉移組。通過比較兩組病人間年齡、性別、腫瘤部位、大小、病理類型、分化程度、T分期、N分期、術前癌胚抗原(CEA)、血清糖鏈抗原19-9(CA19-9)的差異，尋找結直腸癌腹膜種植轉移的危險因素。
　　 第二章:2010年4月到2010年12月在中國廣州南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院手術治療結直腸腺癌伴腹膜種植轉移病人4例，術中收集原發(fā)腫瘤組織和腹膜轉移組織標本，浸泡

8、于RNALater中常溫保存。應用Trizol法提取總mRNA，經(jīng)逆轉錄合成cDNA后經(jīng)體外擴增合成aRNA后用Cy3熒光分子標記，標記后與人類全基因組表達譜芯片雜交，待芯片完全干燥后，利用掃描儀(LuxScan3.0，北京博奧)進行掃描，掃描后將圖像轉化為基于熒光強度的數(shù)字信號(GenePixPro6.0)，隨后進行數(shù)據(jù)分析和處理。采用倍數(shù)法（≥2或≤0.5）確定配對標本間差異表達基因，通過DAVID(TheDatabaseforAn

9、notation，VisualizationandIntegratedDiscovery)分析工具對這組差異表達基因進行基因功能的注釋和基因富集分析，篩選出與腫瘤進展相關的功能類，在這些功能類中挑選差異倍數(shù)較高且參與多個功能類的基因進行半定量熒光RT-PCR驗證。
　　 第三章:收集2003年1月～2010年12月間廣州南方醫(yī)院普外科行手術治療的結直腸腺癌伴腹膜轉移病人的組織蠟塊，獲取正常組織蠟塊標本40塊，腫瘤原發(fā)組織蠟塊標本

10、66快，腹膜轉移組織蠟塊標本42塊，另外從數(shù)據(jù)庫中選取5年隨訪期內(nèi)無腹膜轉移發(fā)生的病人原發(fā)腫瘤蠟塊標本68塊，作為對照組。采用SP法檢測CTHRC1蛋白在不同組織標本間表達水平的差異，一抗采用兔抗人CTHRC1多克隆抗體，購于美國AbCam公司，實驗步驟按試劑盒說明書進行。CTHRC1蛋白主要分布于細胞膜及胞漿中，呈棕黃色顆粒，細胞核中不表達。在細胞膜及胞漿中有棕黃色顆粒判定為陽性，無棕黃色顆粒判定為陰性。
　　 第四章:201

11、0年4月到2010年12月間收集的結直腸癌伴腹膜種植轉移病人的手術標本中，選取3例中分化腺癌病人的原發(fā)腫瘤組織和正常組織進行下一步芯片實驗，術中收集原發(fā)腫瘤組織和正常組織標本，浸泡于RNALater中常溫保存，應用Trizol法提取總mRNA，經(jīng)逆轉錄合成cDNA后經(jīng)體外擴增合成aRNA后用Cy3熒光分子標記，標記后與人類全基因組表達譜芯片雜交，待芯片完全干燥后，利用掃描儀(LuxScan3.0，北京博奧)進行掃描，掃描后將圖像轉化為基

12、于熒光強度的數(shù)字信號(GenePixPro6.0)，隨后進行數(shù)據(jù)分析和處理。采用經(jīng)驗貝葉斯法(P≤0.05)確定配對標本間差異表達基因，通過GOTermFinder分析工具對差異表達的基因進行基因本體論(geneontology，GO)分析，對部分差異表達基因進行共表達網(wǎng)絡的構建及半定量熒光RT-PCR驗證。
　　 統(tǒng)計學處理計數(shù)資料采用x2檢驗或fisher確切概率法，計量資料采用獨立樣本t檢驗。對腹膜種植轉移危險因素分析采用

13、BinaryLogistic回歸分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，用log-rank法檢驗，通過構建Cox回歸模型，判定CTHRC1表達是否是影響術后病人生存的危險因素。所有計算采用SPSS13.0軟件包進行，P值取雙尾，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 第一章:從數(shù)據(jù)庫中共選取符合上述要求病例共748例，其中，腹膜轉移組81例(10.8％)，無轉移組667例(89.2％)。單因素分析顯

14、示，腫瘤大小、腫瘤分化程度、腸壁浸潤深度、淋巴結轉移、術前癌胚抗原(CEA)和血清糖鏈抗原19-9(CA19-9)水平與結直腸癌腹膜種植轉移有關。Logistic多因素回歸分析顯示，腸壁浸潤深度、淋巴結轉移以及術前癌胚抗原(CEA)和血清糖鏈抗原19-9(CA19-9)水平與結直腸癌腹膜種植轉移有關。
　　 第二章:根據(jù)倍數(shù)法，在結直腸癌原發(fā)腫瘤組織和腹膜轉移組織中共篩選出差異表達基因217條，其中，在腹膜轉移組織中表達上調(diào)90

15、條，表達下調(diào)127條。GO注釋分析分析發(fā)現(xiàn)在這217條差異表達基因中，有27條與分子功能相關，占25.71％;38條和生物學過程相關，占36.19％;40條和細胞組份有關，占38.1％，在分子功能中，84％與結構分子活性相關，16％和催化活性相關;在生物學過程中，27.94％與生物黏附相關，27.94％與細胞過程相關，5.88％與代謝過程相關，19.12％與結構區(qū)域構建相關，19.12％與結構區(qū)域相關;在細胞組分中，65.57％與細胞外

16、區(qū)域相關，34.43％與細胞外區(qū)域部分相關。通過功能聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要集中在細胞外區(qū)域及細胞間黏附等15個GOterms中。進一步對90條表達上調(diào)基因進行功能注釋富集分析，結果發(fā)現(xiàn)共有17個基因功能分類Terms出現(xiàn)在富集分數(shù)＞4的3個功能注釋簇中，其功能類型涉及細胞間黏附、細胞外基質(zhì)連接、生物黏附等。在這17個功能類中挑選人白細胞活化黏附因子(activatedleukocytecelladhesionmolecule，ALC

17、AM)、鈣黏附素11（Cadherin-11，CDH11）、基質(zhì)金屬蛋白酶-7（matrixmetallopeptidase7，MMP7）、組織金屬蛋白酶抑制劑1(tissuemetallopeptidaseinhibitor1，TIMP1)、膠原三股螺旋重復蛋白1（collagentriplehelixrepeatcontaining1，CTHRC1）這5條基因作為下一步研究方向。通過半定量熒光RT-PCR驗證，無假陽性結果。

18、　　 第三章:腹膜轉移組病人正常組織CTHRC1陽性表達率為20％，原發(fā)腫瘤組織中為68.2％，腹膜轉移組織中為85.7％，無腹膜轉移組病人CTHRC1陽性表達率為22.1％。腹膜轉移組病人原發(fā)腫瘤組織(x2=23.127，P=0.000)及腹膜轉移組織(x2=35.580，P=0.000)CTHRC1表達水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義，且腹膜轉移組織中CTHRC1表達水平高于原發(fā)腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(x2=4.208，P=

19、0.040)。另外腹膜轉移組病人原發(fā)腫瘤組織中CTHRC1表達水平高于無腹膜轉移組病人(x2=28.814，P=0.040)，差異有統(tǒng)計學意義。生存分析顯示CTHRC1表達陽性組的累積總生存率(x2=18.689，P=0.000)及無病生存率(x2=17.057，P=0.000)低于CTHRC1表達陰性組，Cox回歸證實CTHRC1表達陽性組患者術后死亡風險是CTHRC1表達陰性組患者的2.061倍，CTHRC1表達陽性組患者術后復發(fā)和

20、轉移的風險是CTHRC1表達陰性組患者的1.946倍。
　　 第四章滿足P≤0.05的基因共有98個，相對于正常組織，在腫瘤組織中表達上調(diào)的基因有41個，腫瘤組織表達下調(diào)的基因有57個。通過向GOTERMFINDER服務器提交的是最后的98個差異表達基因符號列表，通過選擇FunctionOntology得出p≤0.01的GOterm，發(fā)現(xiàn)基因主要集中在proteinbinding(GO:0005515)這一功能類中。從此功能類中

21、挑選S100鈣結合蛋白P(S100calciumbindingproteinP,S100P)、抗氧化蛋白1(peroxiredoxin1，PRDX1)、分泌型白細胞蛋白酶抑制因子(secretoryleukocytepeptidaseinhibitor,SLPI)。對三個基因采用GENEMANIA工具進行共表達網(wǎng)絡的構建，發(fā)現(xiàn)三個基因在網(wǎng)絡中有共表達趨勢，SLPI在S100P和PRDX1中起到橋梁的作用。對這三條基因進行半定量熒光RT-

22、PCR驗證，無假陽性結果。
　　 結論:
　　 1.腫瘤浸潤漿膜層、淋巴結轉移、CEA≥10ug/L及CA19-9≥74U/ml是結直腸癌腹膜種植轉移的危險因素。
　　 2.結直腸癌原發(fā)癌組織與腹膜轉移組織間存在大量差異表達基因，提示在腫瘤發(fā)生轉移的過程中，轉移的腫瘤細胞為適應轉移部位微環(huán)境的變化繼連續(xù)發(fā)生特有基因的集聚，對不同組織間基因表達差異的比較，有助于揭示結直腸癌腹膜轉移發(fā)生的機制，為尋找生物學標記及治療

23、靶向提供依據(jù)。
　　 3.在腹膜轉移組織中篩選出的ALCAM、CDH11、MMP7、TIMP1、CTHRC1這5條基因的表達上調(diào)與結直腸癌腹膜轉移密切相關。
　　 4.結直腸腫瘤組織中存在著CTHRC1的高表達，并與腫瘤分化程度、侵潤深度及淋巴結轉移相關。
　　 5.CTHRC1在結直腸癌腹膜轉移的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并可能成為早期診斷的生物學標記之一。
　　 6.CTHRC1表達強度和結直腸癌