輸尿管完全梗阻大鼠腎臟不可逆損傷差異蛋白質的篩選和鑒定.pdf

1、目的：
　　蛋白質組學可動態(tài)、整體、定量地觀察梗阻性腎病發(fā)生、發(fā)展中蛋白質種類、數(shù)量的改變，結合功能蛋白質組的研究，依托雙向電泳和質譜分析的體系和生物功能信息分析，有希望找到調控腎臟不可逆損傷進程關鍵作用的蛋白分子。本研究擬采用雙向電泳分離單側輸尿管完全梗阻（complete unilateral ureteralobstruction CUUO）腎臟組織與正常對照腎臟組織的總蛋白質，建立雙向電泳圖譜，尋找表達差異點，通過質譜分析

2、鑒定，確定與腎臟不可逆損傷發(fā)生、發(fā)展相關的蛋白質。并采用Real-time PCR、免疫組化/免疫熒光及Western blot方法在mRNA水平和蛋白質水平對其在動物模型及腎積水患兒腎臟組織中的表達差異進行驗證，分析其與細胞凋亡及氧化應激作用的關聯(lián)性。以期通過此研究，為進一步揭示梗阻性腎病的發(fā)病機制，尋找腎臟不可逆損傷有意義的生物學標記物及治療的靶點，提供新的線索和思路。
　　方法：
　　1、將2月齡SD(Sprague-

3、Dawley rat)大鼠隨機分成CUUO12h、CUUO24h、CUUO72h和正常對照組，共4組，每組各6只，取腎臟組織，應用雙向電泳及蛋白質質譜分析技術，尋找CUUO動物模型腎臟組織在不同梗阻時間點差異表達的蛋白質。
　　2、應用Real-time PCR、免疫組化及Western blot方法在mRNA水平和蛋白質水平對ANXA4和PRDX1在動物模型腎臟組織中的表達差異進行驗證。
　　3、應用Real-time P

4、CR、免疫熒光及Western blot方法在mRNA水平和蛋白質水平對ANXA4和PRDX1在6例腎積水患兒腎臟組織及6例腎胚瘤患兒瘤旁正常腎臟組織中的表達差異進行驗證。
　　4、用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗組與對照組間比較采用兩樣本的t檢驗，實驗組組間比較采用ANOVE檢驗，p＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　1、CUUO腎臟組織與正常對照組腎臟組織的雙向電泳圖譜分辨率高、

5、重復性好。選擇表達差異2倍以上的69個點，經(jīng)質譜分析和蛋白質數(shù)據(jù)庫檢索成功鑒定出39個蛋白，結合生物功能信息分析，涉及細胞凋亡、線粒體能量代謝及線粒體損傷、氧化應激等多方面。
　　2、對鑒定出的差異蛋白進行了生物功能信息分析，選擇確定梗阻性腎病相關蛋白候選分子ANXA4和PRDX1進行深入研究。
　　動物模型中，免疫組化結果顯示ANXA4在腎小管細胞胞漿和胞膜中高表達，呈棕黃色，平均光密度值在正常對照組為0.0986±0.0

6、237，CUUO12h組為0.1322±0.0228，CUUO24h組為0.1466±0.0179，CUUO72h組為0.1505±0.0201;Real-time PCR結果顯示ANXA4 mRNA的表達在CUUO12h組是正常對照組的1.17倍，在CUUO24h組是正常對照組的1.41倍，在CUUO72h組是正常對照組的1.48倍;Western blot結果顯示ANXA4的相對強度在正常對照組為0.6411±0.0092，CUUO

7、12h組為0.7166±0.0364，CUUO24h組為0.9182±0.0137，CUUO72h組為1.0654±0.0324; ANXA4在CUUO各組與正常對照組相比有顯著差異，CUUO組組間相比有顯著差異，P＜0.05。
　　免疫組化結果顯示PRDX1在腎小管細胞胞漿中高表達，呈棕黃色，平均光密度值在正常對照組為0.1062±0.0229，CUUO12h組為0.1384±0.0209，CUUO24h組為0.1196±0.0

8、141，CUUO72h組為0.1146±0.0258; Real-time PCR結果顯示PRDX1 mRNA的表達在CUUO12h組是正常對照組的1.37倍，CUUO24h組是正常對照組的1.03倍，CUUO72h組是正常對照組的1.07倍;Western blot結果顯示PRDX1的相對強度在正常對照組為0.7124±0.0710，CUUO12h組為0.9484±0.0635，CUUO24h組為0.7424±0.0626，CUUO7

9、2h組為0.7551±0.0209; PRDX1在CUUO12h組與CUUO24h、CUUO72h及對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。
　　3、免疫熒光結果顯示ANXA4在腎積水患兒腎臟腎小球及腎小管細胞胞漿和胞膜中同時有表達，熒光面積值在正常對照組為0.0455±0.0045，在腎積水組為0.0676±0.0017; Real-time PCR結果顯示ANXA4 mRNA的表達在腎積水組是正常對照組的1.14倍;West

10、ern blot結果顯示ANXA4的相對強度在正常對照組為0.9667±0.0075，在腎積水組為1.0259±0.0186; ANXA4在腎積水組與正常對照組相比有顯著差異，p＜0.05。
　　免疫熒光結果顯示PRDX1在腎小球及腎小管細胞胞漿中同時有表達，熒光面積值在正常對照組為0.38±0.0282，在腎積水組為0.52±0.02; Real-time PCR結果顯示PRDX1 mRNA的表達在腎積水組是正常對照組的1.10

11、倍;Western blot結果顯示PRDX1的相對強度在正常對照組為1.2316±0.0141，在腎積水組為1.3487±0.0116;PRDX1在腎積水組與正常對照組相比有顯著差異，p＜0.05。
　　結論：
　　1、運用雙向電泳技術結合質譜分析及生物功能信息分析篩選并鑒定出的39個差異蛋白質可能與梗阻性腎病的發(fā)生、發(fā)展有關。
　　2、應用Real-time PCR、免疫組化/免疫熒光及Western blot技術