清開靈注射液致小鼠IgE介導的過敏反應模型建立與綠原酸變應原性研究.pdf

1、清開靈注射液具有清熱解毒、化痰通絡、鎮(zhèn)靜安神和醒腦開竅的功效，在臨床上使用廣泛。但隨著臨床應用日益增多，清開靈注射液的不良反應報告也逐漸增加，不良反應主要表現為用藥30 min內即可發(fā)生藥物熱、皮膚反應或過敏性休克，其中重癥過敏反應嚴重限制了清開靈注射液的臨床應用。因此，找出清開靈注射液中致重癥過敏反應的主要物質，是保障清開靈注射液安全使用的關鍵。
　　 目前，國內學者對清開靈注射液致類過敏反應研究較為透徹，初步發(fā)現了梔子、金銀

2、花提取物和膽酸可能是引起類過敏反應的物質;而清開靈注射液致IgE介導的過敏反應仍處于初級階段，僅僅建立了一些簡單的BN大鼠速發(fā)過敏模型;不少學者通過碳二亞胺法制備綠原酸完全抗原，發(fā)現綠原酸可能可以作為一種半抗原引發(fā)免疫應答，還有不少學者則認為綠原酸并非半抗原，而是其中的雜質物-異綠原酸為半抗原，顯然，僅有一種偶聯(lián)方法并不足以說明綠原酸具有變應原性。
　　 因此，本研究擬對清開靈注射液致IgE介導的過敏反應動物模型進行深入研究，并

3、利用建立此模型的技術路線對具有爭議性的綠原酸進行變應原性驗證研究，為篩查出清開靈注射液中致重癥過敏反應的主要物質、保障清開靈注射液安全使用奠定基礎。
　　 目的:
　　 1、建立清開靈注射液致Balb/c小鼠IgE介導的過敏反應模型，為后續(xù)篩查清開靈注射液中致重癥過敏反應的主要物質奠定基礎。
　　 2、利用建立IgE介導的過敏反應動物模型的技術路線對綠原酸進行變應原性研究。
　　 方法:
　　 1

4、、清開靈注射液致Balb/c小鼠IgE介導的過敏反應模型的建立
　　 (1)陽離子化牛血清白蛋白(cBSA)的制備及鑒定:將牛血清白蛋白(nBSA)、EDA和EDC按照相關合成方法制備cBSA，然后采用陽離子交換法對完全抗原進行分離純化，同時輔以紫外分光光度法(UV-Vis)和紅外光譜法(FT-IR)進行鑒定。
　　 (2)清開靈-cBSA完全抗原的制備及鑒定:利用Mannich反應將清開靈注射液凍干粉偶聯(lián)至cBSA上制

5、備完全抗原，然后采用陽離子交換法對完全抗原進行分離純化，同時輔以UV-Vis和FT-IR進行鑒定。
　　 (3)清開靈-cBSA完全抗原刺激Balb/c小鼠實驗:將18只Balb/c小鼠隨機分成3組:清開靈-cBSA偶聯(lián)物+鋁佐劑（實驗組），OVA+鋁佐劑組（陽性對照組），生理鹽水組（陰性對照組）。實驗組多點皮下注射0.3 mL偶聯(lián)物與佐劑的混合物（含0.05 mg偶聯(lián)物），其他組以等劑量多點皮下注射。在初次免疫后第14d、21

6、d、28d、35d，以相同劑量皮下注射加強免疫，每次加強免疫后30 min內觀察小鼠體征表現，參照相關標準進行評分統(tǒng)計，同時眼后眥靜脈采血約0.5 ml，分離出來的血清-20℃儲藏，用于血清中組胺和總IgE的含量測定。第35d取實驗組、生理鹽水組小鼠全血并解剖，將肺組織置于10％的甲醛中，用于病理切片檢查。
　　 (4)小鼠血清中總IgE、組胺的含量測定:將各時間點的小鼠血清按照試劑盒說明書進行IgE、組胺含量測定，然后采用On

7、e-Way ANOVA方法，比較不同組別間是否有差異。
　　 (5)小鼠肺部組織病理切片觀察:將肺組織用10％甲醛固定，然后包埋于石蠟中，切片成5μl厚，再用H&E染色，最后置于100X電鏡下拍照。
　　 2、綠原酸變應原性研究
　　 (1)陽離子化牛血清白蛋白(cBSA)的制備及鑒定:將牛血清白蛋白(nBSA)、EDA和EDC按照相關合成方法制備cBSA，然后采用陽離子交換法對完全抗原進行分離純化，同時輔以UV

8、-Vis、FT-IR和基質輔助-激光解吸-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)法進行鑒定。
　　 (2)綠原酸-cBSA完全抗原的制備及鑒定:利用Mannich反應將綠原酸偶聯(lián)至cBSA上制備完全抗原，然后采用陽離子交換法對完全抗原進行分離純化，同時輔以UV-Vis、FT-IR和MALDI-TOF-MS法進行鑒定。
　　 (3)綠原酸-cBSA完全抗原刺激Balb/c小鼠實驗:將6只Balb/c小鼠隨機分成2組:偶聯(lián)

9、物1、偶聯(lián)物2組。實驗組多點皮下注射0.3 mL偶聯(lián)物與鋁佐劑的混合物（含0.1 mg偶聯(lián)物）。在初次免疫后每隔2周以相同劑量皮下注射加強免疫，每次加強免疫后30 min內觀察小鼠體征表現，進行評分統(tǒng)計;實驗組初免前1d靜脈后眼眶采血0.5 ml作陰性對照，第三次加強免疫后取全血;采集的血先室溫靜置30 min，然后4℃，2000 rmp離心10 min，分離出來的血清-20℃儲藏，用于抗血清的效價測定。
　　 (4)小鼠抗血清

10、效價測定:包被96孔酶標板，4℃孵育過夜;用含1％nBSA的PBS溶液于37℃封閉，加入不同稀釋度的抗血清，37℃孵育，加入羊抗鼠酶標抗體，37℃孵育，加TMB雙液，于37℃反應20 min，然后加終止液，用酶標儀讀出各孔在450 nm處的吸光度值。陰性對照用未免疫過的小鼠血清，空白對照為PBS。每一稀釋比的供試品設置3個平行孔。血清供試品的A450 nm值(P)與陰性對照的A450 nm值(N)之比(P/N)大于2即為陽性，反之則為陰

11、性，以P/N大于2的血清最高稀釋倍數作為抗體的效價。
　　 結果:
　　 1、清開靈注射液致Balb/c小鼠IgE介導的過敏反應模型建立
　　 通過對nBSA進行陽離子化修飾，應用Mannich反應制備清開靈-cBSA完全抗原，陽離子交換法分離純化，并利用UV-Vis、FT-IR對其進行鑒定，鑒定結果表明清開靈-cBSA偶聯(lián)成功;用清開靈-cBSA偶聯(lián)物刺激小鼠后，小鼠出現瘙癢、立毛、扭體等過敏體征;與陰性對照組

12、比較，實驗組小鼠各個時間點的血清中總IgE、組胺含量均升高(P＜0.01，P＜0.05);與陽性對照組比較，實驗組小鼠各個時間點的血清中總IgE、組胺含量并無顯著性差異(P＞0.05);肺部組織病理切片顯示肺部受到明顯損傷:肺泡融合、中性粒細胞浸潤、肺部充血、氣管壁有輕度破損;以上各項指標都說明清開靈-cBSA完全抗原成功使Balb/c小鼠發(fā)生IgE介導的過敏反應，模型建立成功。
　　 2、綠原酸變應原性研究
　　 通過

13、對nBSA進行陽離子化修飾，應用Mannich反應制備綠原酸-cBSA完全抗原，陽離子交換法分離純化，并利用UV-Vis、FT-IR和MALDI-TOF-MS法對其進行鑒定，三種鑒定結果均表明綠原酸-cBSA偶聯(lián)成功;用清開靈-cBSA偶聯(lián)物刺激小鼠后，小鼠出現瘙癢、立毛、扭體等過敏體征;同時，兩實驗組小鼠均成功獲得了針對特異性綠原酸的抗血清，且效價均為1:4000。
　　 結論:
　　 通過將nBSA進行修飾，然后利用

14、Mannich反應制備清開靈-cBSA完全抗原，受刺激后的小鼠出現瘙癢、立毛、扭體等過敏體征，血清總IgE、組胺升高，肺部病理切片顯示肺泡融合、充血、氣管壁破損，說明清開靈-cBSA完全抗原成功使Balb/c小鼠發(fā)生IgE介導的過敏反應，利用該技術路線建立清開靈注射致Balb/c小鼠IgE介導的過敏反應模型是可行的。同時，利用該技術路線成功制備綠原酸-cBSA完全抗原，并獲得了高效價的抗血清，更進一步說明了綠原酸可作為半抗原引發(fā)免疫應答