內(nèi)皮祖細胞和p38 MAPK抑制劑聯(lián)合治療糖尿病小鼠缺血性腦卒中及其影像學評價.pdf

1、本文分以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 p38 MAPK抑制劑體外影響高糖環(huán)境中內(nèi)皮祖細胞功能的實驗研究
　　目的：本實驗旨在分離、培養(yǎng)及鑒定小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，體外驗證高糖環(huán)境對EPCs功能的影響，觀察p38 MAPK抑制劑是否可以改善高糖環(huán)境中EPCs功能，并比較新型抑制劑RWJ67657與傳統(tǒng)抑制劑SB203580體外保護EPCs的效能。

2、r>　　材料和方法：采用密度梯度離心法從小鼠骨髓中分離培養(yǎng)出EPCs，通過細胞形態(tài)學、細胞免疫熒光染色、流式細胞儀檢測細胞表面標記物及體外成管能力多方位鑒定EPCs特性。用含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)EPCs，通過MTT、β-半乳糖甘酶細胞衰老、AnnexinⅤ細胞凋亡、細胞粘附、遷移、成管及ELISA實驗觀察高糖對EPCs數(shù)量及功能的影響。在高糖培養(yǎng)液(25mM)中分別加入RWJ67657（1μM）和SB203580（1μM），W

3、estern Blot測定p38 MAPK磷酸化水平，并通過上述一系列細胞實驗比較EPCs數(shù)量及功能的變化。
　　結(jié)果：免疫熒光、流式細胞儀檢測及體外成管實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)第14天的細胞CD133、CD34和VEGFR2表達均呈陽性，并且在基質(zhì)膠上能夠形成典型的管腔樣結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)的EPCs在高糖環(huán)境中增殖能力明顯下降，而且隨著葡萄糖濃度越高，細胞增殖能力下降程度越高，與甘露醇對照組相比差異顯著（P＜0.05）。Western B

4、lot顯示隨著葡萄糖濃度的增加，EPCs的p38 MAPK磷酸化水平逐漸增加，而RWJ67657和SB203580可以顯著降低細胞p38 MAPK的磷酸化水平(P＜0.05)。細胞凋亡和成管實驗顯示p38 MAPK抑制劑可以明顯改善高糖對EPCs存活及成管能力的影響，且RWJ67657較SB203580效果更為顯著(P＜0.05)。此外，p38 MAPK抑制劑能夠顯著降低高糖對EPCs衰老、粘附、遷移及VEGF分泌的影響(P＜0.05)

5、。
　　結(jié)論：體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源性細胞大部分具有造血干細胞及內(nèi)皮細胞特性，符合EPCs生物學特性，能在體外增殖并分化為內(nèi)皮細胞。葡萄糖呈量效性減少EPCs數(shù)量并影響其功能，兩種p38 MAPK抑制劑均可以改善高糖環(huán)境中EPCs功能，且新型抑制劑RWJ67657與傳統(tǒng)抑制劑SB203580相比，保護EPCs的效能更高、毒性更低。
　　第二部分 多功能分子影像探針在野生型和糖尿病型缺血性腦卒中模型鼠中活體示蹤內(nèi)皮祖細胞的實驗研

6、究
　　目的：應用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和近紅外熒光成像（near-infraredfluorescence imaging，NIRFI）動態(tài)監(jiān)測移植的外源性內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，觀察其在野生型及2型糖尿病腦卒中模型鼠體內(nèi)的歸巢現(xiàn)象，并在活體狀態(tài)下評估p38 MAPK抑制劑RWJ67657對EPCs歸巢的影響。
　

7、　材料和方法：構(gòu)建多功能分子影像探針，以順磁性螯合物和熒光基團修飾，體外標記培養(yǎng)的小鼠骨髓源性EPCs。將探針標記的或未標記的EPCs經(jīng)患側(cè)頸內(nèi)動脈泵入野生型或2型糖尿病小鼠缺血性腦卒中模型體內(nèi)，移植的細胞量約為106(100μl)，分別于移植后1、3、5、7、10、14天不同時間點進行MR和NIRF成像，成像結(jié)束后處死小鼠，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀定量腦組織中的Gd含量，并通過免疫熒光染色在離體水平觀察EPCs遷移及歸巢情況。
　

8、　結(jié)果：MRI和NIRFI結(jié)果顯示，野生型模型鼠腦缺血部位的信號強度在探針標記的EPCs移植后第5天達到峰值，其病灶處信號強度及離體組織Gd含量與探針未標記的EPCs移植組相比具有顯著差異性（P＜0.05）。免疫熒光染色顯示探針標記的EPCs移植后第5天，在腦組織微血管中可以觀察到CD133、CD34、VEGFR2與探針中羅丹明共染的雙陽性細胞，說明部分EPCs確實歸巢至腦缺血部位。此外，在探針標記的EPCs移植后第5天，糖尿病小鼠腦缺

9、血部位MR和NIRF成像信號強度均顯著低于野生型小鼠(P＜0.05)。而RWJ67657連續(xù)灌胃顯著增加糖尿病小鼠腦缺血部位的信號強度(P＜0.05)，提示更多的外源性EPCs遷移歸巢至腦缺血部位。
　　結(jié)論：本實驗所建立的雙模態(tài)成像方法可以用于在體無創(chuàng)監(jiān)測移植的外源性EPCs。通過該多模態(tài)成像方法，觀察到2型糖尿病明顯降低外源性EPCs歸巢至腦缺血部位的數(shù)量，連續(xù)RWJ67657灌胃治療卻能夠促使更多的外源性EPCs歸巢至糖尿病

10、小鼠腦缺血部位。
　　第三部分 內(nèi)皮祖細胞移植和p38 MAPK抑制劑聯(lián)合治療糖尿病小鼠缺血性腦卒中的實驗研究
　　目的：本實驗旨在通過T2加權(quán)成像(T2-weighted imaging，T2WI)和彌散張量成像(diffusiontensor imaging，DTI)，結(jié)合組織病理學方法研究內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)移植和RWJ67657聯(lián)合治療對糖尿病小鼠缺血性腦卒

11、中預后的作用。
　　方法：小鼠骨髓源性EPCs（約106個）經(jīng)患側(cè)頸內(nèi)動脈移植入2型糖尿病小鼠缺血性腦卒中模型體內(nèi)，RWJ67657自建模前30min起連續(xù)灌胃7天(每天1次、每次50 mg/kg)。分別在建模前及建模后第1、7、14、21天進行模型鼠神經(jīng)功能評分;在建模后第7天進行T2WI掃描、Western Blot及免疫組化染色;在建模后14天進行DTI掃描及髓鞘堿性蛋白免疫組化染色。
　　結(jié)果：單獨EPCs移植或RW

12、J灌胃治療均不能顯著改善糖尿病小鼠缺血性腦卒中的預后，盡管RWJ67657表現(xiàn)出顯著的抗炎作用(P＜0.05)。RWJ灌胃及EPCs移植聯(lián)合治療卻可以顯著協(xié)同促進糖尿病腦卒中后的血管新生(P＜0.05)及神經(jīng)發(fā)生（P＜0.05）。聯(lián)合治療組小鼠在建模第7天Western Blot證實VEGF及BDNF的表達明顯增加、T2WI顯示腦梗塞體積顯著降低，第14天DTI顯示腦白質(zhì)纖維數(shù)量增加，第21天神經(jīng)功能缺陷明顯改善(P＜0.05)。