可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑AUDA在動脈粥樣硬化中的作用及機制研究.pdf

1、背景:心腦血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是導致人類致殘、致死的主要原因，為嚴重威脅人類健康的流行病。而動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)能夠引起心肌梗塞和腦梗塞，是心腦血管疾病發(fā)生的最主要原因之一。對動脈粥樣硬化疾病的有效預防及對其進展的合理控制是心血管病的預防和治療的關鍵所在。研究證實環(huán)氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)可通過抗炎作用對血

2、管炎癥和動脈粥樣硬化性疾病進行預防。而可溶性環(huán)氧化物水解酶(Soluble epoxide hydrolase，sEH)能夠將EETs轉化為生物活性較低的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids，dHET)，從而降低EETs抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用。因此，抑制sEH能夠減少EETs的降解并有效延長它們的作用時間，更大程度上發(fā)揮EETs對機體的保護作用?？扇苄原h(huán)氧水解酶抑制劑(sEHinhibito

3、rs)不僅能夠在高血壓大鼠中有效的降低血壓，而且能夠在小鼠敗血癥模型中顯著降低炎癥反應，并且有證據(jù)表明可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑能夠在炎癥性疼痛中表現(xiàn)出抗疼痛的作用。由于可溶性環(huán)氧水解酶在心臟中廣泛表達并在一些疾病模型中表現(xiàn)出抗炎癥的作用，而動脈粥樣硬化也是一種炎癥性的血管疾病，本研究擬嘗試使用可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑對動脈粥樣硬化疾病進行治療并探討其可能的機制。
　　研究目的:明確可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑12-（3-金剛烷-脲基）月桂酸

4、衍生物[12-(3-adamantan-1-yl-ureido) dodecanoic acid, AUDA]是否具有抗動脈粥樣硬化的治療作用，并探討其作用機制，為AUDA的臨床應用提供理論依據(jù)和實驗基礎。本論文擬從以下兩部分展開研究:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA對動脈粥樣硬化小鼠的療效分析:建立小鼠動脈粥樣硬化模型，為下一步研究提供模型基礎;優(yōu)化可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA的作用濃度，并評估其對動脈粥樣硬化小鼠的治

5、療效應。
　　2.探討可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA治療動脈粥樣硬化的作用機制。
　　方法:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA對動脈粥樣硬化小鼠的療效分析:
　　(1)動脈粥樣硬化小鼠模型的建立:選用8周齡的ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠，高脂飲食兩周后，行頸動脈縮窄手術模擬血管狹窄，繼續(xù)給予高脂飲食分別至16周和24周。同品系的C57BL/6野生型小鼠作為對照。
　　(2)生化檢測動脈粥樣硬

6、化小鼠血漿中血脂各成分的水平:收集8周、16周及24周的ApoE-/-小鼠，并以同年齡同樣處理的C57BL/6小鼠作為對照，檢測血漿中總膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三脂(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(High density lipoproteins，HDL)的水平來跟蹤疾病的發(fā)展過程。
　　(3)病理學檢測動脈粥

7、樣硬化斑塊的形成過程:左側頸動脈斑塊制備連續(xù)石蠟切片，以蘇木精-伊紅染色觀察血管的形態(tài)學特征。
　　(4)通過第一部分所建立的動脈粥樣硬化小鼠模型，使用不同濃度的可溶性環(huán)氧酶抑制劑AUDA從10周開始對動脈粥樣硬化進行治療，在第18周時分離各組小鼠的血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)檢測血漿中的腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TN

8、F-α)、白介素6(Interleukin6，IL6)、金屬基質蛋白酶2(Metal matrix proteinase-2，MMP-2)、金屬基質蛋白酶9（Metal matrix proteinase-9，MMP-9）、血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）、轉化生長因子β(Transform growth factorβ，TGF-β)、血管內皮細胞粘附分子1(vas

9、cular celladhesion molecule1，VCAM-1)、細胞間粘附分子(intercellular cell adhesionmolecule-1，ICAM-1)、血漿和血小板P選擇素(P-selectin)的水平的變化，并確定可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA的優(yōu)化治療濃度。
　　(5)采用優(yōu)化濃度的AUDA對動脈粥樣硬化模型小鼠進行治療，通過體重測量和血脂生化指標的分析評價AUDA的治療效應;同時通過病理學檢測動

10、脈粥樣硬化斑塊的大小及占血管管腔的面積百分比。
　　2.探討可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA治療動脈粥樣硬化的作用機制:
　　(1)從10周開始，采用優(yōu)化濃度的AUDA對動脈粥樣硬化小鼠模型進行治療，連續(xù)治療8周后，收集獲得血管，通過血管切片和免疫組化分析，評估單核巨噬細胞的浸潤和血管平滑肌細胞的含量。
　　(2)收集血管，抽提獲得血管蛋白，通過免疫印跡法，檢測小鼠主動脈壁Toll樣受體4(Toll like recep

11、tor4，TLR4)和核因子κB(Nuclear factorκb，NF-κb)的表達變化。
　　結果:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA對動脈粥樣硬化小鼠的療效分析:
　　(1)動脈粥樣硬化小鼠模型的評價:
　　ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠的血脂水平檢測發(fā)現(xiàn)，與同齡的C57BL/6小鼠相比，ApoE-/-小鼠的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和在低密度脂蛋白(LDL)在第8周(

12、p＜0.05)、16周(p＜0.05)和24周(p＜0.05)時均有顯著升高。
　　同時，蘇木素伊紅染色的結果顯示，ApoE-/-小鼠8周時，血管壁僅出現(xiàn)內膜略微增厚，且沒有明顯的斑塊形成。在進行縮窄術并對小鼠進行高脂喂養(yǎng)到16周時，血管內膜有明顯的增厚，平滑肌增生形成較厚的纖維帽。當小鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng)到24周時，血管的狹窄程度顯著增加，纖維帽明顯變薄，斑塊表面僅有很薄的內皮細胞覆蓋，平滑肌細胞減少，斑塊內呈現(xiàn)多個空泡樣的結構即壞死

13、核。而同齡的C57BL/6小鼠在任一時間點均無明顯的斑塊形成。這些結果表明動脈粥樣硬化小鼠模型建立成功。
　　(2) AUDA對動脈粥樣硬化小鼠炎癥因子、粘附分子和細胞外基質分子水平的影響，及其治療濃度的優(yōu)化:
　　不同濃度AUDA灌注治療ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠發(fā)現(xiàn)，0.35 mg/kg和0.45mg/kg的AUDA均能夠顯著降低ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠血漿炎癥因子（TNF-α、IL6和TGF-β)、粘附分子（

14、VCAM-1、ICAM-1和p-selectin）和細胞外基質分子（MMP2和MMP9）的水平。且0.35 mg/kg的AUDA治療后，這些因子的表達水平已恢復至與C57BL/6陰性對照小鼠相當?shù)乃?。因此，確立0.35 mg/kg為優(yōu)化的動脈粥樣硬化小鼠的治療濃度。
　　(3) AUDA對動脈粥樣硬化的療效分析:
　　對動脈粥樣硬化小鼠體重和血脂的檢測發(fā)現(xiàn)，經過AUDA灌注的小鼠的體重要明顯低于生理鹽水灌注的小鼠。另外，對

15、血脂各成分檢測發(fā)現(xiàn)，總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)及低密度脂蛋白(LDL cholesterol)在經過AUDA灌注的ApoE-/-小鼠中要顯著低于生理鹽水灌注的ApoE-/-小鼠。而高密度脂蛋白(HDL cholesterol)在經過AUDA灌注的ApoE-/-小鼠中仍高于生理鹽水灌注的ApoE-/-小鼠。
　　此外，對動脈粥樣硬化小鼠血管病理學分析發(fā)現(xiàn)，從主動脈的切片中可見經過AUDA灌注的ApoE-/-小鼠的主動脈竇動脈

16、粥樣硬化面積相比于對照小鼠有顯著的減少（2.78±0.09 mm2 vs.0.89±0.07 mm2; p＜0.05）。經過AUDA灌注的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積占管腔面積的百分比也顯著低于對照小鼠[(3.5±1.0)％vs.（20.5±0.9)％,p＜0.05]。
　　2.探討可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA治療動脈粥樣硬化的作用機制:
　　(1)單核巨噬細胞的浸潤和血管平滑肌細胞的數(shù)量減少:相比于生理鹽水灌注

17、的對照小鼠，AUDA均能夠顯著降低ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠血管中單核巨噬細胞的浸潤程度和血管平滑肌細胞的數(shù)量。
　　(2) TLR4-NF-κb信號通路的抑制:相比于生理鹽水灌注對照小鼠，AUDA均能夠顯著降低ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠血管TLR4和NF-κB分子的表達水平。
　　結論:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA能夠控制ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠的體重和血脂的增加，降低其斑塊的面積和血管再狹

18、窄的程度，具有顯著的療效。
　　2.可溶性環(huán)氧酶抑制劑AUDA對ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠的治療作用是通過影響炎癥因子、粘附分子和細胞外基質分子的水平;減輕單核巨噬細胞的浸潤程度和降低血管平滑肌細胞的數(shù)量;抑制TLR4-NF-κb信號通路的活化實現(xiàn)的。
　　3.可溶性環(huán)氧酶抑制劑AUDA具有血管保護作用，可能可以作為治療的藥物應用于臨床實踐。
　　創(chuàng)新性和意義：
　　本研究主要通過體內動物模型，對可溶性環(huán)氧水

19、解酶抑制劑AUDA對動脈粥樣硬化的治療作用及機制進行了探討，對防治動脈粥樣硬化相關的心血管疾病具有重要的理論價值和潛在的應用價值。本研究的主要創(chuàng)新點和意義如下:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA對動脈粥樣硬化的治療，0.35 mg/kg為優(yōu)化的動脈粥樣硬化治療的濃度。為這種新型的治療制劑應用于臨床治療動脈硬化提供了理論和實驗的依據(jù)。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA能夠通過影響炎癥因子、粘附分子和細胞外基