模擬調強放療模式對人鼻咽低分化鱗癌細胞株生物效應影響研究.pdf

1、目的：鼻咽癌是人類常見的惡性腫瘤之一，尤其在我國南方高發(fā)，放射治療作為首選治療。調強放射治療（intensity-modulated radiation therapy IMRT）技術作為先進放療技術的代表，突破了傳統(tǒng)常規(guī)放療的規(guī)則大野照射，以不規(guī)則的多個子野從多個角度在保護危及器官及正常組織的同時，最大限度的給予腫瘤區(qū)域以較高劑量照射；IMRT還可實現(xiàn)同時補量技術，在治療次數(shù)相同的情況下，給不同的靶區(qū)不同劑量。以期提高局控率并減少周圍

2、正常組織損傷，因而成為臨床腫瘤放射治療走向精確定位、精確計劃設計、精確治療的標志。近年來，IMRT因其技術優(yōu)勢廣泛應用于臨床腫瘤放射治療實踐中，如頭頸部腫瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等。IMRT在物理學上的優(yōu)勢是顯而易見的。關于IMRT放療近期療效的報道很多，而且大多數(shù)結果尚屬滿意，但至今沒有大范圍的、有說服力的這種治療改善了預后的資料。因此推測這一技術在在生物學上可能存在不足之處。因為治療技術的復雜性，使在常規(guī)照射時一次性給予的劑量分成

3、了多次給予，尤其是MLC靜態(tài)IMRT技術大大延長了照射時間。常規(guī)2Gy的照射1～2min即可完成，而IMRT則常常需要20～40min。這樣單位時間內腫瘤吸收劑量就大大降低，有人將這種情況稱為“相對劑量率降低”。這種照射模式所致“相對劑量率降低是否影響腫瘤細胞的殺滅”已成為臨床放射生物學的熱點問題。多年來，人們應用細胞培養(yǎng)、免疫組化、分子生物學技術等對腫瘤細胞相關基因蛋白表達情況進行了研究，積累了大量資料。也有作者就離體細胞IMRT照射

4、后，細胞存活曲線的變化進行過研究，從而推斷IMRT照射時間延長，可能導致亞致死性損傷修復增加，放射生物效應降低，但其確切影響仍不清楚，未見其他方面深入的報道。放射治療模式的改變是否會影響腫瘤細胞的生物效應尚未明確，是否要對IMRT照射模式進行劑量補償亦尚未定論。文獻報道，影響細胞放射敏感性的生物因素主要包括DNA損傷的修復、細胞周期、及細胞凋亡。因此本研究旨在通過給予人鼻咽低分化鱗癌細胞株（CNE-2）不同模式照射，探索IMRT治療模式

5、對CNE-2生物效應的影響。為今后IMRT在臨床上的廣泛應用，放療劑量的調整，縮短照射時間，從而提高腫瘤局控率，進一步提高遠期生存率，提供實驗依據(jù)。并依據(jù)檢測指標的變化，為患者制定個體化的放療方案，如：確定分割劑量，選擇照射時間，提供理論依據(jù)。
　　 方法：選取CNE-2為實驗對象，分為空白對照、常規(guī)照射、模擬IMRT（按設計要求對各個照射劑量點進行照射，每個劑量點分5 次照射,其間分別間隔8.0-8.5min， 35min完成

6、）3組，分別給予6MV-X 2、4、6、8Gy4個劑量點的照射；1）運用克隆形成實驗（courtenay assay），檢測不同照射模式下CNE-2的存活分數(shù)； 2）運用四氮唑藍法（MTT）進一步驗證克隆形成實驗的結果；3）運用流式細胞儀（FCM）檢測不同照射模式下CNE-2的細胞周期分布及凋亡比例；4）應用RT-PCR及Western blotting方法，檢測CNE-2在不同照射模式下，與DNA損傷修復相關的Ku、ATM轉錄水平及蛋

7、白表達；檢測與細胞周期調控相關的Cyclin B1、Cyclin D1的轉錄水平及蛋白表達，檢測與細胞凋亡調節(jié)相關的Bcl2、Bax的轉錄水平及蛋白表達。
　　 結果：
　　 1．克隆形成檢測細胞存活分數(shù)：
　　 1）CNE-2 α/β值為13.177Gy，在2、4、6、8Gy劑量點，常規(guī)照射組：SF值分別為0.225,3±0.017,7、0.013±0.002,0、0.002,6±0.000,6和0.0,002

8、±0.000,1，模擬IMRT組：SF分別為0.335,3±0.016,7、0.060,7±0.009,3、0.006,9±0.000,9和0.000,6±0.0,003；模擬IMRT組的SF均高于常規(guī)照射組。
　　 2）根據(jù)線性二次方程擬合的CNE-2細胞存活曲線，常規(guī)放療組：α、β、N、D0、Dq值分別為0.674,8、0.051,2、1.890,0、0.885,0、0.563,0，模擬IMRT組：α、β、N、D0、Dq值分

9、別為0.537,7、0.026,8、2.610,0、0.986,0和0.946,0；α常規(guī)＞αIMRT，β常規(guī)＞βIMRT，N常規(guī)〈N IMRT，D0常規(guī)＜D0IMRT，Dq 常規(guī)＜DqIMRT。
　　 2．MTT檢測細胞增殖比例：
　　 CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點，常規(guī)照射組：細胞增殖比例分別為0.598,7±0.021,7、0.455,7±0.053,7、0.235,3±0.045,3、0.056,7±0.

10、018,3；模擬IMRT組：細胞增殖比例分別為0.682±0.055,0、0.528,3±0.074,3、0.322,3±0.002,0、0.091,7±0.022,3；模擬IMRT組的增殖比例均高于常規(guī)照射組。
　　 3．流式細胞術檢測細胞周期分布(%)：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點
　　 1）常規(guī)照射組：G2期細胞比例分別為26.77±0.43、38.33±1.77、46.57±1.43、66.97±1.47

11、；模擬IMRT組：G2期細胞比例分別為21.07±0.87、30.83±1.67、39.47±3.03、56.87±2.50；在8Gy劑量點時，2組的CNE-2 G2期細胞比例均高達50%以上（66.97±1.47%與56.87±2.50%）。G2期細胞比例隨照射劑量的增加而逐漸增加；在相同劑量點，模擬IMRT組G 2期細胞比例低于常規(guī)照射組。
　　 2）常規(guī)照射組：S期細胞比例37.50±0.20、26.47±0.97、19.

12、23±0.97、13.67±0.73；模擬IMRT組：S期細胞比例分別為39.73±0.47、32.43±1.03、26.07±2.77、16.87±2.33。S期細胞比例隨照射劑量的增加而逐漸減少；在相同劑量點，模擬IMRT組的S期細胞比例高于常規(guī)照射組。
　　 3）常規(guī)照射組：G1期細胞比例分別為35.73±0.23、35.20±0.80、34.20±0.50、19.37±0.73；模擬IMRT組：G1期細胞比例分別為39.

13、20±0.40、36.73±0.63、34.47±0.33、26.27±0.27。G1期細胞比例隨照射劑量的增加無明顯變化；在相同劑量點，模擬IMRT組的G1期細胞比例略高于常規(guī)照射組。
　　 4．流式細胞術檢測細胞凋亡比例及存活比例（%）：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點
　　 1）常規(guī)照射組：早期凋亡比例分別為13.67±1.63、21.07±1.73、28.87±3.33、16.47±1.83；模擬IMRT組：

14、早期凋亡比例分別為10.60±1.20、15.77±0.43、21.30±2.10、29.97±4.47；2Gy、4Gy、6Gy三個照射劑量點，早期凋亡比例隨照射劑量的增加而逐漸增加；照射劑量為8Gy時，隨劑量的增加，常規(guī)照射組早期凋亡比例不再增加反而下降；在相同劑量點，模擬IMRT組的早期凋亡比例低于常規(guī)照射組（8Gy除外）。
　　 2）常規(guī)照射組：晚期凋亡比例分別為3.33±0.67、10.57±1.73、25.10±3.4

15、0、70.20±2.90；模擬IMRT組：晚期凋亡比例分別為1.80±0.90、7.13±1.37、21.77±2.47、59.37±3.67。晚期凋亡比例隨照射劑量的增加成倍增加；在相同劑量點，模擬IMRT組的晚期凋亡比例低于常規(guī)照射組。
　　 3）常規(guī)照射組：存活比例分別為82.83±1.67、47.40±4.90、21.73±6.93、5.13±1.37；模擬IMRT組：存活比例分別為87.40±2.10、54.70±3.

16、50、27.80±5.30、7.57±1.77。細胞存活比例隨照射劑量的增加而降低；在相同劑量點，模擬IMRT組的存活比例高于常規(guī)照射組。
　　 5．RT-PCR、Western blotting方法檢測CNE-2 Ku80、ATM的轉錄水平及蛋白表達：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點
　　 1）常規(guī)照射組：Ku80的轉錄水平分別為0.588±0.131、0.929±0.125、0.840±0.084、0.775±0

17、.084；模擬IMRT組：Ku80的轉錄水平分別為0.730±0.097、1.074±0.104、0.961±0.076、0.911±0.071；各組不同劑量點之間Ku80的轉錄水平差異均有統(tǒng)計學意義（P均=0.000）；在相同劑量點，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，4個劑量點Ku80的轉錄水平差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；接受照射后CNE-2 Ku80轉錄水平升高，模擬IMRT組Ku80的轉錄水平更高（P均=0.0

18、00），在4Gy劑量點時2組細胞Ku80的轉錄水平到達峰值，隨后表達均下降。
　　 2）常規(guī)照射組：ATM轉錄水平分別為0.908±0.110、1.057±0.313、0.923±0.133、0.823±0.075；模擬IMRT組：ATM的轉錄水平分別為0.732±0.189、0.903±0.181、0.871±0.067、0.775±0.130；接受照射后，與空白對照比較，2組CNE-2 ATM轉錄水平均上調（P均＜0.005

19、）；各組不同劑量點之間，ATM的轉錄水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；在相同劑量點，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，ATM的轉錄水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。
　　 Western blotting方法檢測CNE-2 Ku80、ATM的蛋白表達均得到相似結果。
　　 6．PT-PCR、Western blotting方法檢測CNE-2 Cyclin B1、Cyclin D1的轉錄水平及蛋白

20、表達：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點
　　 1）常規(guī)照射組：Cyclin B1的轉錄水平分別為0.745±0.068、0.624±0.100、0.518±0.054、0.428±0.038；模擬IMRT組：Cyclin B1的轉錄水平分別為0.881±0.075、0.711±0.054、0.617±0.061、0.528±0.046；2組Cyclin B1的轉錄水平隨照射劑量的增加而降低；各組不同劑量點之間，Cyclin

21、B1的轉錄水平差異均有統(tǒng)計學意義（P均=0.000）；且在相同劑量點，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，Cyclin B1的轉錄水平差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），模擬IMRT組Cyclin B1的轉錄水平高于常規(guī)照射組。
　　 2）常規(guī)照射組：Cyclin D1的轉錄水平分別為0.857±0.090、0.810±0.327、0.798±0.303、0.802±0.038；模擬IMRT組：Cyclin D1的轉錄

22、水平分別為0.822±0.063、0.701±0.213、0.812±0.093、0.801±0.064，各組不同劑量點之間轉錄水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；在相同劑量點，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，Cyclin D1的轉錄水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。
　　 Western blotting方法檢測CNE-2 Cyclin B1、Cyclin D1的蛋白表達均得到相似結果。
　　

23、 7．PT-PCR、Western blotting方法檢測CNE-2 Bcl2、Bax的轉錄水平及蛋白表達：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點
　　 1）常規(guī)照射組： Bcl2的轉錄水平分別為0.298±0.029、0.308±0.024、0.290±0.033、0.273±0.025；模擬IMRT組：Bcl2的轉錄水平分別為0.313±0.030、0.297±0.028、0.294±0.021、0.293±0.025；各組

24、不同劑量點之間，轉錄水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；在相同劑量點，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，Bcl2的轉錄水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。
　　 2）常規(guī)照射組：Bax的轉錄水平分別為0.618±0.061、0.706±0.032、0.817±0.064、0.915±0.076；模擬IMRT組：Bax的轉錄水平分別為0.513±0.051、0.606±0.087、0.662±0.132、0.

25、721±0.086；2組Bax的轉錄水平隨照射劑量的增加而升高；各組不同劑量點之間，Bax的轉錄水平差異均有統(tǒng)計學意義（P均=0.000）；在相同劑量點，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，Bax的轉錄水平差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），模擬IMRT組Bax的轉錄水平低于常規(guī)照射組。
　　 Western blotting方法檢測CNE-2 Bcl2、Bax的蛋白表達均得到相似結果。
　　 結論:
　

26、　 1．照射時間延長，CNE-2存活分數(shù)增加，提示對腫瘤細胞的殺滅減少，在此期間可能發(fā)生亞致死性損傷修復，放射敏感性下降，放射生物效應降低。
　　 2．電離輻射誘導CNE-2 G2期阻滯，其阻滯作用隨劑量增加而增加；模擬IMRT照射時間的延長，對G2期細胞阻滯作用減弱。電離輻射誘導CNE-2凋亡，細胞凋亡比例隨照射劑量的增加而增加，細胞存活比例隨照射劑量的增加而降低。模擬IMRT照射時間延長，CNE-2凋亡比例下降及存活比例均

27、上升，導致輻射生物效應降低。流式細胞術較好地反映了輻射對CNE-2細胞周期分布及凋亡比例的影響。
　　 3．應用RT-PCR、Western blotting方法檢測ATM、Ku80、Cyclin D1、Cyclin B1、Bcl2及Bax的轉錄水平及蛋白表達，并計算 Bcl2/Bax的比值，可能有助于評價CNE-2放射生物效應的改變。IMRT時間延長，可能有利于SLDR，降低放射敏感性。DNA損傷修復相關因子Ku80、ATM，